銀杏葉提取物對二甲苯中毒性肝損傷防治機制的研究

米紅梅，張娜，劉寧

二甲苯（xylene）是一種揮發性液體，隨著工業發展，二甲苯用途越來越廣泛，但近年來因意外或長期接觸二甲苯導致中毒的病例也日益增多[1?2]，筆者亦曾報道1例慢性二甲苯中毒導致重度肝損傷的病例[3]。以往研究多是通過形態學改變研究二甲苯中毒導致的器官損傷[4]，其分子生物學水平的研究報道較少，其導致肝功能損傷的確切機制尚不明確，目前臨床尚無針對其治療的特效藥物。有研究發現銀杏葉提取物（ginkgo biloba extract，GBE）對酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝炎等均具有一定保護作用[5?6]，但其對二甲苯中毒所致的肝損傷是否具有保護作用尚不明確。本研究通過建立小鼠二甲苯中毒肝損傷模型，采用GBE進行干預實驗，探討其對二甲苯中毒小鼠肝損傷的干預效果和機制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級健康昆明種小鼠30只，體質量18～22 g，購自河北醫科大學。銀杏葉提取物注射液（悅康藥業集團有限公司17.5 mg/5 mL）；氣相色譜儀（山東瑞普分析儀器有限公司）；二甲苯（天津市永大化學試劑有限公司）；X線片、顯影液、定影液（廈門銳珂醫療器材有限公司）；鼠抗鼠β?actin單克隆抗體、兔抗鼠腫瘤壞死因子α（TNF?α）多克隆抗體、兔抗鼠核轉錄因子?κB（NF?κB）多克隆抗體（上海生工生物工程公司）；辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗小鼠IgG抗體（北京中杉金橋生物技術有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及染毒模型制備 按照隨機數字表法將小鼠分為正常對照組（Control組）、模型組（Model組）、銀杏葉提取物干預組（GBE組），每組10只。3組均自由進食，Model組和GBE組均通過吸入濃度為110～130 mg/m3（采集箱內空氣樣本，用氣相色譜直接進樣法測得）氣體二甲苯制備二甲苯中毒肝損傷模型[4]，Control組小鼠吸入空氣。GBE組腹腔注射50 mg/（kg·d）[6]的銀杏葉提取物注射液，因腹腔注射操作不當死亡1只；Control組和Model組均腹腔注射等量生理鹽水，2組小鼠全部存活。喂養8周后，實驗小鼠禁食12 h，在深度麻醉下摘眼球取血，4℃離心分離血清。部分肝組織以4%中性甲醛固定，備做病理切片，其余肝組織用液氮快速冷凍、置于?80℃冰箱保存，備提取RNA、蛋白。

1.2.2 血清生化指標檢測 應用日本Olympus AU 5400全自動生化分析儀酶法測定各組血清丙氨酸轉氨酶（ALT）、天冬氨酸轉氨酶（AST）、總膽紅素（TBIL）、堿性磷酸酶（ALP）、γ?谷氨酰轉移酶（GGT）水平。

1.2.3 肝組織病理學觀察 4%中性甲醛固定后的標本依次進行梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，5 μm連續切片，進行常規蘇木精?伊紅（haematoxylin and eosin，HE）染色。光學顯微鏡下觀察肝組織病理改變。

1.2.4 采用逆轉錄聚合酶鏈反應（RT?PCR）檢測肝組織NF?κB和TNF?α mRNA表達 各基因引物序列由上海生工生物工程公司設計并合成，引物序列見表1。Trizol試劑一步法提取肝組織總RNA，以寡脫氧核苷酸和M?MLV逆轉錄酶制備cDNA。用TaqDNA多聚酶擴增cDNA產物，各基因的擴增反應條件為：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，擴增40個循環。以2%瓊脂糖電泳分離擴增產物，溴化乙啶染色后以Bio?profif凝膠圖像分析儀進行圖像采集，以3?磷酸甘油醛脫氫酶（glyceraldehyde?3?phosphate dehydroge?nase，GAPDH）為內參照。采用Quantity one分析軟件進行半定量分析，結果以各基因和內參的灰度比值表示。

Tab.1 NF-κB,TNF-α and GAPDH primer sequences表1 NF-κB、TNF-α及GAPDH引物序列

1.2.5 Western blot檢測肝組織NF?κB和TNF?α表達 以含蛋白酶抑制劑的組織裂解液提取肝組織蛋白，紫外分光光度計（280 nm）測定蛋白濃度。在室溫條件下電泳，起始電壓80 V，待蛋白溶液通過濃縮膠后將電壓改為120 V繼續電泳，待溴酚藍到達距分離膠下緣上1 cm時，停止電泳。取下凝膠，在半干轉印槽中0.8 mA/cm2恒流狀態下進行轉膜，根據蛋白的分子質量確定轉膜時間。封閉后，分別與鼠抗鼠β?actin單克隆抗體（1∶500）、兔抗鼠TNF?α多克隆抗體（1∶200）、兔抗鼠NF?κB多克隆抗體（1∶200）反應，4℃過夜后與相應的二抗進行免疫反應，化學發光顯色，膠片曝光顯影。以β?actin為內參照。采用Quantity one分析系統軟件對Western blot結果進行半定量分析，結果以目的蛋白與β?actin的積分吸光度比值表示。

1.3 統計學方法 應用SPSS 18.0統計軟件進行數據處理，計量資料以均數±標準差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較行SNK?q法，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組血清生化指標比較 與Control組比較，Model組 ALT、AST、TBIL、ALP、GGT明顯升高（均P＜0.05）；與Model組比較，GBE組ALT、AST、TBIL均明顯降低（均P＜0.05），ALP、GGT與Model組差異無統計學意義（均P＞0.05），見表2。

2.2 肝組織病理光鏡下觀察 Control組小鼠肝組織未見明顯異常。Model組小鼠肝組織可見肝細胞腫大，部分肝細胞呈脂肪樣變性，局部可見炎性細胞浸潤及點灶狀肝細胞壞死灶。與Model組比較，GBE組肝組織炎癥程度減輕。見圖1。

Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes between three groups表2 各組小鼠血清生化指標比較 （±s）

Tab.2 Comparison of serum biochemical indexes between three groups表2 各組小鼠血清生化指標比較 （±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與Model組比較，P＜0.05

組別Control組Model組GBE組F n 10 10 9 ALT（U/L）31.20±7.19 276.00±46.57a 77.00±12.47ab 205.75＊AST（U/L）33.20±3.63 267.20±52.56a 72.22±12.97b 153.70＊TBIL（μmol/L）13.40±3.25 35.92±6.83a 26.88±7.04ab 36.59＊ALP（U/L）81.60±20.82 220.20±66.06a 180.44±28.47a 26.56＊GGT（U/L）32.34±10.06 110.74±37.10a 88.24±15.52a 27.71＊

Fig.1 HE staining of liver tissue sections of three groups of mice(×200)圖1 各組小鼠肝組織病理學改變（HE染色，×200）

2.3 各組肝組織NF?κB和TNF?α mRNA表達水平比較 與Control組比較，Model組TNF?α、NF?κB mRNA表達水平明顯升高（均P＜0.05）；與Model組比較，GBE組TNF?α、NF?κB mRNA表達水平降低（均P＜0.05）。見圖2、3，表3。

Fig.2 The mRNA expression of TNF?α in liver(RT?PCR)圖2 各組小鼠肝組織TNF?α mRNA表達（RT?PCR）

Fig.3 The mRNA expressions of NF?κB of liver(RT?PCR)in three groups圖3 各組小鼠肝組織NF?κB mRNA表達（RT?PCR）

2.4 各組肝組織NF?κB和TNF?α蛋白表達水平比較 與Control組比較，Model組TNF?α、NF?κB蛋白表達水平明顯升高（均P＜0.05）。與Model組比較，GBE組NF?κB、TNF?α蛋白表達水平降低（均P＜0.05）。見圖4、5，表4。

Tab.3 Expressions of NF-κB and TNF-α mRNA in livertissue of mice表3 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α mRNA表達（±s）

Tab.3 Expressions of NF-κB and TNF-α mRNA in livertissue of mice表3 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α mRNA表達（±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與Model組比較，P＜0.05

組別Control組Model組GBE組F n 10 10 9 TNF?α 0.59±0.04 1.35±0.11a 1.09±0.08ab 217.36＊NF?κB 0.60±0.07 1.42±0.09a 1.02±0.05ab 288.84＊

Fig.4 The protein expression of TNF?α in liver tissue of mice圖4 各組小鼠肝組織TNF?α蛋白表達

3 討論

二甲苯是具有芳香氣味的揮發性液體，主要經呼吸道、皮膚、消化道等吸收進入機體，對機體組織器官造成損傷。本研究發現，在二甲苯誘導的肝損傷模型中，小鼠短時間內接觸高劑量二甲苯可導致肝細胞水腫，炎性細胞浸潤及肝細胞壞死灶形成；血清ALT、AST、TBIL、ALP、GGT明顯升高，提示造模成功，短期內接觸大量二甲苯可以導致肝組織損傷。銀杏葉提取物干預組肝臟炎癥較模型組明顯減輕，血清ALT、AST、TBIL降低，提示銀杏葉提取物可以減輕二甲苯誘導的肝臟炎癥反應。

Fig.5 The protein expression of NF?κB in liver tissue of mice圖5 各組小鼠肝組織NF?κB蛋白表達

Tab.4 Expressions of NF-κB and TNF-α protein in liver tissue of mice表4 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α蛋白表達（±s）

Tab.4 Expressions of NF-κB and TNF-α protein in liver tissue of mice表4 各組小鼠肝組織NF-κB、TNF-α蛋白表達（±s）

＊P＜0.05；a與Control組比較，b與Model組比較，P＜0.05

組別Control組Model組GBE組F n 10 10 9 TNF?α 0.71±0.08 1.25±0.12a 0.92±0.06ab 86.29＊NF?κB 0.65±0.04 1.30±0.14a 0.84±0.05ab 148.36＊

NF?κB是一種調控炎癥基因轉錄的核因子，在炎癥反應中起著重要的作用。生理情況下呈非活性狀態，當細胞受到刺激后NF?κB活化，活化的NF?κB可調控TNF?α、白細胞介素、黏附分子等炎癥因子的表達[7?8]，參與炎癥反應。本研究結果顯示，在二甲苯誘導的肝損傷模型中，伴隨肝臟炎癥的發生，模型組肝組織NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白表達顯著上調，肝臟炎癥程度與NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白表達趨勢一致，推測其可能的機制為：二甲苯刺激肝細胞后導致NF?κB活化，活化后的NF?κB作為上游細胞因子調控下游TNF?α的合成和釋放，從而導致肝細胞炎癥發生。另外TNF?α作為細胞外刺激因子，與其受體結合后在蛋白激酶C的輔助下，激活NF?κB，進一步放大炎癥反應，形成惡性循環。

銀杏葉提取物具有抗炎、抗氧化、改善循環等多種藥理學作用，其主要化學成分為黃酮類、萜內酯類等。本研究發現，銀杏葉提取物干預組血清ALT、AST、TBIL較模型組明顯降低，與張曉蘋等[9]研究結果一致，提示銀杏葉提取物可以減少肝細胞水腫、壞死，減輕肝細胞炎癥反應。本研究中銀杏葉提取物干預組血清ALP、GGT與模型組無明顯差異；張曉蘋等[9]應用銀杏葉提取物對CCl4誘導的肝纖維化大鼠進行干預實驗，結果示ALP較模型組明顯下降，兩實驗結果不一致。而高曉倩等[10]研究不同劑量銀杏葉提取物對ALP的影響，發現50 mg/（kg·d）劑量組ALP與模型組差異無統計學意義。結合本研究及既往研究結果，推測其原因可能為本實驗銀杏葉提取物用量小導致治療效果欠佳有關。本研究結果顯示，銀杏葉提取物干預組NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白均較模型組降低，其變化趨勢與ALT、AST變化趨勢一致，推測銀杏葉提取物可能是通過抑制NF?κB、TNF?α炎癥因子的表達，從而顯著改善二甲苯誘導的肝臟炎癥反應。白紀紅等[11]研究發現，在非酒精性脂肪性肝炎模型中，銀杏葉提取物可通過降低NF?κB、TNF?α mRNA和蛋白表達水平，從而減輕肝細胞損傷，表現其抗炎活性，與本研究結果一致。

綜上所述，銀杏葉提取物可以減輕二甲苯誘導的肝臟炎癥反應，其機制可能與抑制NF?κB、TNF?α基因表達有關。