前處理對咖啡綠原酸高效液相色譜檢測的影響

蔡嘉慧，董相書，何飛飛，郝淑美

(云南大學農學院，云南昆明 650550)

綠原酸(chromogenic acid, CGA)是咖啡豆中重要的非揮發性物質，是咖啡的杯品及風味的重要影響因素之一。 Clifford 等[1]從綠咖啡豆中分離出30多種綠原酸，其中最主要的三類是咖啡酰奎寧酸(caffeoylquinic acid, CQA)、二咖啡酰奎寧酸 (di-caffeoylquinic acid, diCQA)和阿魏酰奎尼酸(feruloylquinic acids, FQA)。綠原酸具有抗菌、消炎的功效，能預防心血管疾病、2-型糖尿病、老年癡呆癥等疾病[2-3]，是一種對人類健康有益的、重要的植物衍生物[4]。綠原酸在植物體內的代謝過程中也扮演著重要的角色，是植物體內合成G型和S型木質素重要的先導物質，同時還具有保護植物細胞和抗環境脅迫等作用[5-6]。

鑒于綠原酸是衡量咖啡質量的一項重要指標，準確測量咖啡中綠原酸含量顯得十分重要。目前咖啡綠原酸的提取方法主要有乙醇提取法[7]、異丙醇提取法[8]、甲醇提取法[9]、水提取法[10-11]等，檢測方法常用的為高效液相色譜法(HPLC)。為進一步優化綠原酸高效液相色譜測定的前處理方法，制定快捷、有效的測定標準，筆者通過比較現有不同前處理方法下綠原酸測定結果的差異性，選擇相對快速簡便且安全無毒的前處理方法，以期建立準確、快速、安全的綠原酸提取測定方法，也為咖啡綠原酸的工業生化生產和咖啡品種的區別、鑒定和品質評判提供技術支持。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1咖啡樣品與標準品。生咖啡豆收集自云南保山潞江壩和德宏芒市。綠原酸標準使用液(200 μg/mL)：稱取綠原酸標準品(GBW09528)0.02 g于10 mL容量瓶中，加流動相溶解并定容至標定刻度線，混勻后準確吸取1 mL于10 mL容量瓶中，加流動相稀釋至刻度，混勻。

1.1.2主要儀器。Alliance 2695型高效液相色譜儀，色譜柱為Waters SunFire C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，2489紫外檢測器，固定相C18填料粒度5 μm，流動相A為甲醇∶乙酸=98∶2，流動相B為水∶乙酸=98∶2，按0 min(20A+80B)、10 min(45A+55B)、20 min(90A+10B)、25 min(20A+80B)極性梯度條件洗脫，柱溫30 ℃，柱流量1 mL/min，波長340 nm，進樣體積10 mL。

1.2方法

1.2.1液氮處理。處理1(液氮凍干)，生咖啡豆液氮凍干處理，研磨。處理2(對照)，生咖啡豆直接研磨。上述樣品過40目篩，稱取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL 70%甲醇，超聲波提取30 min，用70%甲醇定容，過0.45 μm 濾膜。

1.2.2提取劑篩選。

1.2.2.1水提取法。參照Surez-Quiroz等[10]的方法，取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL純水。80 ℃的暗環境下超聲波提取30 min后純水定容。

1.2.2.2乙醇提取法。參照劉雪飛[12]的方法，取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL 60%乙醇，室溫下超聲波提取30 min，用60%乙醇定容。

1.2.2.3甲醇提取法。參照Farah等[9]的方法，取1.000 g咖啡粉于25.0 mL容量瓶中，加入20 mL 40%甲醇，室溫下超聲波提取30 min，用40%甲醇定容。

1.2.3生咖啡豆綠原酸含量分析。對保山和芒市收集的56個云南小粒咖啡樣品，利用“1.2.1”和“1.2.2”得到的適宜的前處理方法測定其綠原酸含量。

2 結果與分析

2.1綠原酸色譜圖及標準曲線對綠原酸標準品進行HPLC檢測，得到標準品的綠原酸色譜圖(圖1)。以樣品濃度x(mg/L)對峰面積y求出回歸方程并繪制標準曲線。綠原酸標準曲線方程為y=1.198×107x-1 619.6，相關系數r=0.999 8。

圖1 綠原酸標準品的綠原酸色譜圖Fig.1 Chromatogram map of chlorogenic acid of the standard sample

2.2液氮處理的比較從表1可看出，經液氮處理后研磨的生咖啡豆綠原酸含量為47.60 mg/g，顯著高于未經液氮處理的25.93 mg/g。綠原酸熱穩定性差，液氮使得咖啡樣品凍干，減少了研磨發熱導致的綠原酸分解。因此，液氮凍干研磨顯著提高了前處理的準確性。

表1液氮處理對咖啡綠原酸測定的影響

Table1Effectofliquidnitrogentreatmentonthedeterminationofcoffeechlorogenicacid

前處理方法Pretreatment method綠原酸Chlorogenic acid∥mg/g相對標準偏差RSD%相對誤差Relative error∥%液氮凍干研磨Liquid nitrogen freeze-drying grinding47.60±2.48*5.213.78非凍干研磨Non-lyophilized grinding25.93±1.315.073.67

注: *表示凍干和非凍干處理間差異達到顯著水平(P<0.05)

Note: * indicates that the difference between freeze-dried and non-lyophilized treatment reached a significant level (P<0.05)

2.3提取劑的比較由表2可知，乙醇和甲醇提取的綠原酸含量分別為44.60和43.70 mg/g，顯著高于水提取的22.40 mg/g，此外，乙醇和甲醇提取的相對標準偏差和相對誤差更小，說明其精密度更高。鑒于甲醇具有毒性，則將乙醇提取法作為該試驗的推薦方法。

2.4主產區咖啡生豆綠原酸含量范圍對于在咖啡主產區-保山潞江壩和德宏芒市采集的56份樣品，用液氮凍干研磨-乙醇提取超聲輔助的方法進行綠原酸提取，同時還測定了新綠原酸和隱綠原酸的含量，結果見表3。綠原酸含量、新綠原酸含量和隱綠原酸含量的平均值分別為35.20、3.11、5.64 mg/g,同分異構體中綠原酸比例最高，為80%。

表2不同提取劑對咖啡綠原酸測定的影響

Table2Effectofdifferentextractantsonthedeterminationofcoffeechlorogenicacid

提取劑Extractant綠原酸Chlorogenic acid∥mg/g相對標準偏差RSD%相對誤差Relative error∥%水Water22.40±3.13b13.99.73乙醇Ethanol44.60±0.26a0.580.42甲醇Methanol43.70±0.71a1.621.37

注:不同提取劑間不同小寫字母表示差異達到顯著水平(P<0.05)

Note: Different lowercase letters betwween different extractants indicate that the difference reached a significant level (P<0.05)

表3主產區咖啡綠原酸含量范圍

Table3Rangeofcoffeechlorogenicacidcontentinthemainproducingareas

指標Index含量Contentmg/g平均值Mean valuemg/g同分異構體比例Isomer ratio%綠原酸Chlorogenic acid27.70～46.6035.2080新綠原酸New chlorogenic acid1.65～5.653.117隱綠原酸Hypochlorogenic acid3.57～9.335.6413

3 討論與結論

該試驗擬通過對比液氮凍干磨樣，以及水提取法、甲醇提取法、乙醇提取法3種前處理方法對咖啡中綠原酸含量檢測的影響，以期建立準確、快速、安全的綠原酸提取測定方法。結果表明，與未凍干樣品相比，液氮凍干的咖啡豆中綠原酸檢測結果高出1倍，準確度更高，是值得推薦的綠原酸提取前處理方法。與水提取方法相比，乙醇和甲醇提取方法準確度更高，相對誤差更小，特別是乙醇提取過程中不涉及有毒藥品，是更為理想的綠原酸提取劑。

綜合考慮提取效率及安全性，該試驗確定液氮凍干研磨-60%乙醇提取為最優的綠原酸前處理方法，鑒于其精密度高、安全性高，推薦作為今后綠原酸含量檢測的參考方法。