HPLC-DAD同時檢測飼用植物提取物中非法添加喹乙醇和乙酰甲喹的含量

吳 昊，劉發全，宋亞偉，丁在亮

(安徽省獸藥飼料監察所，安徽合肥 230091)

飼用植物提取物是采用適當的溶劑或方法，從植物全部或者某一部分為原料提取或加工而成，具有一種或多種生物學功能[1]，添加在動物飼料中能起到促進生長、抗菌、抗病毒、增加動物免疫力、增強肉品風味和動物采食量等作用的活性物質，是理想的飼用抗生素替代品[2-3]。喹乙醇、乙酰甲喹屬于喹噁啉類合成抗菌藥，對革蘭氏陰性菌有很強的殺菌力，特別對致病性溶血性大腸桿菌敏感性最高，添加在飼料中具有明顯的抗菌和促生長作用，可促進蛋白質同化，提高飼料轉化率與瘦肉率，研究發現其具有蓄積毒性和致突變性[4-5]。

農業部第2638號公告發文禁止在飼料中添加喹乙醇、乙酰甲喹，但因其效果好，價格便宜，外觀為淡黃色粉末，常被不法分子非法添加進植物提取物中制成“偽飼料用植物提取物”，這不僅擾亂正常飼用植物提取物市場，而且因藥物殘留會引起食品安全事件，目前針對飼用植物提取物中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的檢測方法鮮見報道。筆者結合飼料中非法添加的特點，建立了準確、簡便、快速的HPLC-DAD檢測方法，為飼用植物提取物中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1主要儀器。美國Agilent公司高效液相色譜儀，型號HP 1260，配四聯梯度泵、在線脫氣機、二極管陣列紫外檢測器(DAD)、自動進樣器和柱溫箱；十萬分之一電子天平，德國賽多利斯，感量0.01 mg，型號CPA225D；超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司。

1.1.2主要試劑。喹乙醇對照品(批號H0061103，含量99.5%)、乙酰甲喹對照品(批號H0070808，含量99.3%)，均購自中國獸醫藥品監察所；飼用植物提取物(A樣)；乙腈、甲醇均為色譜純，美國FISHER Chemical公司；N，N二甲基甲酰胺、磷酸均為分析純，上海試劑公司；水，水質符合實驗室一級用水的規定。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備。精密稱取喹乙醇50.58 mg、乙酰甲喹50.70 mg對照品于100 mL棕色容量瓶，加N，N二甲基甲酰胺10 mL溶解，加甲醇定溶，制成儲備液，分別精密量取喹乙醇、乙酰甲喹儲備液5 mL于50 mL棕色容量瓶混合，加甲醇定溶，制成工作液。

1.2.2供試品溶液的制備。稱取飼用植物提取物試樣2 g，精確至0.000 1 g，置于100 mL容量瓶中，用90%甲醇溶液準確定容，振蕩提取30 min，將試樣提取液轉移至離心管，以3 000 r/min離心10 min，取離心上清液用0.45 μm尼龍濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.2.3色譜分析條件。色譜柱：Agilent公司ZORBAX Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)；流動相：甲醇-磷酸溶液(0.025 mol/L，用三乙胺調節pH=6.0)，按體積比20∶80(V/V)為流動相，流速為1.0 mL/min，200～400 nm波長掃描，測定波長為260 nm，柱溫40 ℃，進樣量10 μL。

1.2.4方法學考察。

1.2.4.1系統適用性試驗。分別吸取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，在“1.2.3”色譜條件下，注入液相色譜儀進行測定，記錄色譜圖，考察系統適應性。

1.2.4.2線性關系的考察。HPLC自動進樣器吸取工作液1、2、5、10、20、40 μL注入HPLC，記錄色譜圖，以進樣濃度X(μg/mL)為橫坐標、峰面積Y為縱坐標繪制標準曲線，計算線性回歸方程。

1.2.4.3精密度試驗。取對照品工作液，按“1.2.3”色譜條件連續進樣6次，測定對照品工作液中喹乙醇、乙酰甲喹峰面積的RSD值。

1.2.4.4穩定性試驗。取供試品溶液，在室溫下放置0、1、2、6、12、24 h后，按“1.2.3”色譜條件，注入液相色譜儀進行測定，進樣量10 μL，測定峰面積積分值，計算RSD。

1.2.4.5重復性試驗。取同一批號的樣品按“1.2.2”方法制備供試品溶液6份，按“1.2.3”色譜條件測定，進樣量為10 μL，測定峰面積，計算平均含量和RSD。

1.2.4.6加樣回收率試驗。分別精密稱取20、40、100 mg喹乙醇、乙酰甲喹原料添加在飼用植物提取物中，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜條件測定，進樣量為10 μL，測定峰面積，計算平均回收率和RSD。

1.2.4.7檢測限與定量限。采用空白飼用植物提取物，乙酰甲喹、喹乙醇添加量逐漸降低，樣品經前處理和液相色譜分析后得到的添加回收率，實際測定得到的回收率和精密度能滿足方法回收率(70%～120%)和精密度(RSD≤10%)要求的最低濃度作為方法檢測限。

1.2.5空白樣品的測定。取不含喹乙醇、乙酰甲喹的飼用植物提取物，按“1.2.2”方法制備供試品溶液，再按“1.2.3”色譜條件測定。

1.2.6樣品結果判定。取飼用植物提取物，每批按“1.2.2”方法制備樣品，按“1.2.3”色譜條件注入液相色譜儀，通過乙酰甲喹、喹乙醇保留時間和光譜匹配度進行定性，測定峰面積，通過標準曲線計算樣品含量。

2 結果與分析

2.1方法學考察

2.1.1系統適用性試驗。圖1～2表明，在“1.2.3”色譜條件下，乙酰甲喹、喹乙醇的保留時間分別為4.5、15.3 min左右，對照品溶液色譜主峰保留時間與供試品保留時間一致，分離度大于1.5，理論塔板數大于6 000。

圖1 對照品喹乙醇(a)和乙酰甲喹(b)紫外光譜圖Fig.1 UV spectrum of reference substance olaquindox(a)and mequindox(b)

圖2 對照品色譜圖Fig.2 Chromatogram of the reference substance

2.1.2線性關系的考察。按“1.2.4.2”方法操作，通過“1.2.3”色譜條件定量測定對照品，得喹乙醇、乙酰甲喹的回歸方程分別為Y=5.37X-9.21(r=0.999 6)、Y=5.34X-4.21 μg/mL(r=0.999 8)，表明喹乙醇、乙酰甲喹濃度分別在5.03～201.32、5.04～201.38 μg/mL與峰面積呈現良好的線性關系。

2.1.3精密度試驗。按“1.2.4.3”方法操作，計算喹乙醇、乙酰甲喹的峰面積RSD分別為0.46%、0.53%(n=6)，保留時間的RSD均小于1%，表明分析方法符合精密度的要求。

2.1.4穩定性試驗。按“1.2.4.4”方法操作，計算試樣中喹乙醇、乙酰甲喹的峰面積RSD為0.44%、0.86%(n=6)，表明供試品溶液在室溫下放置24 h穩定。

2.1.5重復性試驗。按“1.2.4.5”方法操作，測定樣品中喹乙醇、乙酰甲喹的峰面積RSD分別為0.31%、0.42%(n=6)，保留時間的RSD均小于1%，表明此方法重復性良好。

2.1.6加樣回收率試驗。按“1.2.4.6”方法操作，測定樣品中喹乙醇、乙酰甲喹的含量，結果見表1。從表1可以看出，喹乙醇、乙酰甲喹的平均回收率分別為99.76%、99.28%，RSD分別為0.97%、0.78%，表明回收率較好，該方法符合要求。

2.1.7檢測限與定量限。按“1.2.4.7”方法操作，試驗結果表明5 mg/kg是能達到方法回收率和精密度要求的最低濃度。根據10個空白樣品的3倍平均信噪比對應的乙酰甲喹、喹乙醇含量進行添加回收試驗，表明樣品中5 mg/kg添加濃度的回收率雖能達到回收率要求，但精密度高于方法精密度要求，所以該方法檢測限為5 mg/kg，定量限為10 mg/kg。

表1 回收率試驗結果(n=6)

2.2空白樣品的測定按“1.2.5”方法操作，結果見圖3，試驗表明供試品基質對待測物喹乙醇、乙酰甲喹沒有干擾。

圖3 空白樣品色譜圖Fig.3 Chromatogram of blank sample

2.3樣品結果判定按“1.2.6”方法操作，空白樣品色譜圖未檢出喹乙醇、乙酰甲喹，陽性樣品的色譜圖見圖4～5，其喹乙醇、乙酰甲喹出峰的保留時間與對照品一致，初步判定樣品添加了喹乙醇、乙酰甲喹；對陽性樣品光譜圖與對照溶液光譜圖進行比較，圖形非常一致，樣品保留時間分別為4.5、15.2 min，色譜峰純度角0.045°，純度閾值0.248°，純度角小于純度閾值，說明光譜均勻，未包裹共流出物，滿足檢測要求，最終確證樣品中非法添加了喹乙醇、乙酰甲喹。

3 討論

3.1樣品的處理方法該試驗比較了超聲波與振蕩提取方法，發現超聲波提取后的試樣溶液因飼用植物提取物成分復雜，提取液雜質較多，目標物不易分離。有文獻報道[6]，采用HBL小柱對試液凈化，考慮到喹乙醇、乙酰甲喹在飼用植物提取物添加量大于50 mg/kg才能起作用，用HBL小柱凈化后，回收率變化不大，因此采用振蕩提取，提取液離心后直接上機檢測，方法能夠減少雜質干擾，降低成本，回收率穩定。

圖4 供試品喹乙醇(a)和乙酰甲喹(b)紫外光譜圖Fig.4 UV spectrum of sample olaquindox(a)and mequindox(b)

圖5 供試品色譜圖Fig.5 Chromatogram of the sample

3.2流動相的選擇有文獻報道[7]，用甲醇、乙腈、磷酸溶液作為流動相，經試驗發現喹乙醇、乙酰甲喹分離度達不到要求，雜質有干擾，將溶液pH調到6.0，乙酰甲喹保留時間明顯增加，提高分離度同時使峰型得到改善，減少拖尾和雜質干擾。

3.3波長的選擇有文獻報道[8]，采用380 nm測定喹乙醇、乙酰甲喹含量，經二極管陣列紫外檢測器(DAD)全波長掃描，發現喹乙醇、乙酰甲喹在260 nm有最大吸收，380 nm為次吸收，而380 nm靠近可以光，試樣中的色素有干擾，靈敏度不夠，故采用260 nm作為測定波長，可以減少色素干擾，提高靈敏度。

4 結論

該研究建立HPLC-DAD同時檢測飼用植物提取物中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的含量方法，通過試驗，該方法精密度高、重復性好、操作簡便，適用于飼用植物提取物中非法添加喹乙醇、乙酰甲喹的含量檢測。