圖像輔助流式細(xì)胞儀在中華絨螯蟹血細(xì)胞分析中的應(yīng)用

胡錦麗,劉逸塵,任星潮,耿緒云,孫金生,張亦陳

(天津市動植物抗性重點實驗室，天津師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，天津 300387)

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)亦稱河蟹，屬于軟甲綱、十足目、弓蟹科，是我國重要的經(jīng)濟(jì)蟹種。近年來，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大以及養(yǎng)殖環(huán)境的改變，各類疾病暴發(fā)的情況也愈加嚴(yán)重，導(dǎo)致河蟹的生長及品質(zhì)都受到嚴(yán)重的影響，并造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。河蟹是無脊椎動物，尚不具備完善的獲得性免疫能力，主要依靠其非特異性免疫系統(tǒng)抵抗病原，各類血細(xì)胞承擔(dān)了重要的免疫學(xué)功能，通過吞噬、包囊、結(jié)節(jié)和黑化等方式在防御過程中發(fā)揮著重要的作用[1-2]。

國內(nèi)外已經(jīng)有許多學(xué)者對甲殼動物血細(xì)胞的分類開展了一系列研究，但由于各種人工檢測方法的分析原理和判別依據(jù)等的不同導(dǎo)致分類結(jié)果也有差異。例如，多位學(xué)者對克氏原螯蝦各類血細(xì)胞的比例研究結(jié)果就不盡相同[3-5]。流式細(xì)胞儀是分析各種單細(xì)胞及顆粒樣品常用的自動化設(shè)備。醫(yī)學(xué)血液學(xué)檢查中用其進(jìn)行快速定量分析，并將結(jié)果作為重要的診斷參考。利用該類儀器還可將甲殼動物血細(xì)胞分為多個類群[6-8]，但邊界尚不夠清晰，因此應(yīng)用還不普遍。

近年來出現(xiàn)的多維全景分析儀是一種新型圖像輔助流式設(shè)備，可將流式的快速、高通量與多通道實時圖像采集功能相結(jié)合，并改進(jìn)了測量模塊，能夠獲得更多維度的信息以及更為精準(zhǔn)的量化檢測結(jié)果。張樹花等[9]首次將其應(yīng)用于水產(chǎn)動物血細(xì)胞分析，通過圖像輔助可以更為清晰地將鯽魚不同類群的血細(xì)胞區(qū)分開。筆者將圖像輔助流式細(xì)胞儀引入甲殼動物血細(xì)胞分析，嘗試建立一種能夠清晰分群的自動化方法。

1 材料與方法

1.1試驗材料試驗用中華絨螯蟹均購自天津市王頂?shù)趟a(chǎn)批發(fā)市場，體重(104±5) g，置于實驗室養(yǎng)殖系統(tǒng)，水溫為(20±1) ℃，每天投喂2次。暫養(yǎng)5 d后，選取體表無損傷，附肢完整、活力旺盛的個體用于試驗。

1.2試驗試劑抗凝劑，參考洪宇航等[10]配制抗凝劑(338 mmol/L氯化鈉，115 mmol/L 葡萄糖,30 mmol/L 檸檬酸三鈉，10 mmol/L 乙二胺四乙酸二鈉，pH=7.0)。多聚甲醛購自生工生物工程(上海)股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)，分析純。

1.3試驗方法

1.3.1細(xì)胞懸液的制備。按抗凝劑∶血淋巴體積比1∶1，從中華絨螯蟹附肢基部抽取血淋巴，經(jīng)4%多聚甲醛固定后用PBS重懸，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2顯微鏡觀察。將上述細(xì)胞懸液制備滴片，用Leica DM5000型顯微鏡觀察，根據(jù)胞內(nèi)顆粒的差異對細(xì)胞歸類、統(tǒng)計和分析。

1.3.3圖像輔助流式細(xì)胞儀檢測。該研究所使用的Merck Millipore公司的FlowSight多維全景流式細(xì)胞儀是一種圖像輔助流式細(xì)胞儀，較常規(guī)機(jī)型相比具有升級的檢測模塊，除了可以更精準(zhǔn)地測量常規(guī)參數(shù)外，還能同步采集每個細(xì)胞在各通道的圖像。前述細(xì)胞懸液經(jīng)70 μm細(xì)胞篩過濾去除黏連細(xì)胞團(tuán)即可上機(jī)檢測，每個樣本采集3萬個樣點，數(shù)據(jù)和圖像利用隨機(jī)軟件IDEAS Application 進(jìn)行處理和分析。

2 結(jié)果與分析

2.1顯微鏡觀察結(jié)果顯微鏡下可見中華絨螯蟹血細(xì)胞呈橢圓形或近圓形，體積較大的細(xì)胞多呈橢圓形且胞內(nèi)含有可分辨的顆粒狀結(jié)構(gòu)。不同細(xì)胞內(nèi)所含的顆粒結(jié)構(gòu)在大小及含量方面呈現(xiàn)顯著差異，據(jù)此可將其分為r1～r4共4個類群。其中r1類群屬于無顆粒細(xì)胞，其體積最小，胞質(zhì)中沒有明顯可見的顆粒結(jié)構(gòu)，胞核輪廓清晰可見，核質(zhì)比大；r2類群為小顆粒細(xì)胞，體積和形態(tài)與r1類群接近，其顯著特點是胞內(nèi)具有少量散在分布的細(xì)碎小顆粒，這些顆粒形態(tài)不甚規(guī)整，含量變化幅度大；r3類群為中顆粒細(xì)胞，其體積較大，胞質(zhì)內(nèi)均勻分布較多近圓形、中等大小的顆粒，粒徑約為r4類群胞內(nèi)顆粒的3/5，細(xì)胞核多被顆粒遮擋；r4類群是大顆粒細(xì)胞，該類群細(xì)胞體積大，胞質(zhì)內(nèi)充滿近圓形、大小較均勻的大型粒結(jié)構(gòu)，粒徑為細(xì)胞直徑的1/9～1/8，胞核多被顆粒遮擋(圖1)。各個類群細(xì)胞的測量數(shù)據(jù)如表1～2所示。

注:表示無顆粒細(xì)胞； 表示小顆粒細(xì)胞；表示中顆粒細(xì)胞；表示大顆粒細(xì)胞Note:Non-granular hemocyte；Small-granular hemocyte；Intermediate-granular hemocyte；Large-granular hemocyte圖1 顯微鏡觀察分類中華絨螯蟹血細(xì)胞Fig.1 Classicfication of Eriocheir sinensis hemocytes by microscopic observation

細(xì)胞類群Cell group細(xì)胞大小Cell size∥μm×μm顆粒大小Particle size∥μm×μm顆粒含量Particle content無顆粒細(xì)胞Non-granular hemocyte(11.73±0.95)×(9.47±0.50)——小顆粒細(xì)胞Small-granular hemocyte(12.75±1.12)×(10.64±0.97)(1.05±0.09)×(1.01±0.02)﹢中顆粒細(xì)胞Intermediate-granular hemocyte(14.58±0.72)×(12.48±1.29)(1.27±0.14)×(1.08±0.12)﹢﹢﹢大顆粒細(xì)胞Large-granular hemocyte(19.59±2.56)×(13.68±1.19)(2.18±0.31)×(1.85±0.23)﹢﹢﹢﹢

注：細(xì)胞大小和顆粒大小為長徑×短徑。“—”表示胞內(nèi)沒有可見顆粒；“+”表示胞內(nèi)顆粒的豐度，“+”多表示胞內(nèi)顆粒含量多

Note:The cell size and particle size are long diameter x short diameter.“—” means that there are no visible particles in the cell; “+” indicates the abundance of granule,more “+” mean more granules in the cell

2.2圖像輔助流式細(xì)胞儀分析與顯微鏡依據(jù)可見的顆粒結(jié)構(gòu)分類不同，流式細(xì)胞儀通過測量單細(xì)胞樣點的散射特征可以更全面、準(zhǔn)確地反映出中華絨螯蟹血細(xì)胞內(nèi)的全部顆粒結(jié)構(gòu)在分布范圍(Area)和復(fù)雜程度(Intensity)方面的差異，并據(jù)此分類。散點圖中單細(xì)胞樣點呈現(xiàn)分群聚集的狀況，各群之間具有明顯的低密度樣點過渡區(qū)，據(jù)此可將中華絨螯蟹血細(xì)胞清晰地劃分為R1～R4共計4個類群。R1類群細(xì)胞的特征是沒有明顯的散射信號，即胞內(nèi)無復(fù)雜的顆粒結(jié)構(gòu)，同步的明場圖像也提示細(xì)胞近透明狀。R2類群散點分布區(qū)間呈現(xiàn)面積略大、強(qiáng)度較低的特點，表明胞內(nèi)顆粒分布較廣，但顆粒本身的結(jié)構(gòu)相對較簡單，明場通道的圖像顯示胞內(nèi)具有少量折光組分。R3類群細(xì)胞樣點分布區(qū)間向散點圖中的高復(fù)雜度方向偏移，但色散面積沒有顯著增大，即呈現(xiàn)一種顆粒結(jié)構(gòu)復(fù)雜度提高的趨勢，明場通道顯示胞內(nèi)具有更多高反差區(qū)域，表明具有結(jié)構(gòu)更復(fù)雜的成分。R4類群細(xì)胞樣點集中在圖的右上部，即顆粒結(jié)構(gòu)的分布范圍和顆粒復(fù)雜程度都超過前面3個類群，同步采集的圖片顯示該類群細(xì)胞內(nèi)具有大面積的高反差影像，提示其中充滿結(jié)構(gòu)復(fù)雜的成分(圖2)。色散測量反映的是胞內(nèi)全部顆粒的整體狀況，R1～R4類群可以據(jù)此分為無、小、中及大顆粒細(xì)胞4個類群，其占血細(xì)胞總量的比例范圍分別是(54.33±3.38)%、(27.63±2.10)%、(5.43±0.35)%、(12.51±3.38)%(表2)。

進(jìn)一步分析每個類群細(xì)胞的大小分布區(qū)間，結(jié)果顯示，從R1到R4類群細(xì)胞大小分布區(qū)間逐漸右移，即R1

3 結(jié)論與討論

該研究采用2種方法分別依據(jù)明場觀察和色散測量對中華絨螯蟹血細(xì)胞內(nèi)的顆粒結(jié)構(gòu)從不同角度進(jìn)行差異比較，并據(jù)此劃分不同的細(xì)胞類群，因此分類結(jié)果既有相似之處又存在一定差異。針對顆粒特征的2種分析方法都能將中華絨螯蟹血細(xì)胞劃分為4個類群，并觀察到細(xì)胞大小具有隨著胞內(nèi)顆粒增加而增大的趨勢，而且前兩類細(xì)胞的總量遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于后兩類細(xì)胞之和等一致的特點。不同之處在于2種方法分別劃分的各類群細(xì)胞的比例存在差異，其原因主要是測量的依據(jù)不完全一致。顯微鏡觀察分類依據(jù)的是鏡下可見的顆粒結(jié)構(gòu)差異，而圖像輔助流式細(xì)胞儀測量的色散值反映的是胞內(nèi)各種大小顆粒及復(fù)雜結(jié)構(gòu)總量的差異。相比顯微鏡觀察，基于高分辨率測量模塊分析的流式方法具有便于量化、準(zhǔn)確性高、重復(fù)性好且高通量等優(yōu)點，更適合于自動化分析。

注：BF.明場圖像；SSC.色散圖像；R1.無顆粒細(xì)胞；R2.小顆粒細(xì)胞；R3.中顆粒細(xì)胞；R4.大顆粒細(xì)胞Note:BF.Bright field image; SSC.Side scatter image; R1.Non-granular hemocyte;R2.Small-granular hemocyte; R3.Intermediate-granular hemocyte; R4.Large-granular hemocyte圖2 中華絨螯蟹血細(xì)胞流式分析散點圖Fig.2 Scatter plot of blood cell flow analysis of Eriocheir sinensis

圖3 中華絨螯蟹4種血細(xì)胞大小分布Fig.3 Distribution of blood cell size in four species of Eriocheir sinensis

血細(xì)胞具有重要的免疫功能，很多學(xué)者在這方面開展了深入的研究，采用顯微、亞顯微觀察、染色特征分析、流式測量等將多種甲殼動物的血細(xì)胞劃分為3～4個類群甚至更多的亞類(表2)。Gupta[14]依據(jù)染色觀察將束腹蟹(Paratelphusamasoniana)血細(xì)胞分為透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞及顆粒細(xì)胞3類。Zhou等[15]參考顯微及亞顯微結(jié)果，并結(jié)合常規(guī)流式細(xì)胞分析認(rèn)為擬穴青蟹血細(xì)胞也是由前述3種類型構(gòu)成，但各類型細(xì)胞的比例與其他物種差異較大。陸宏達(dá)[11]將中華絨螯蟹的血細(xì)胞進(jìn)行瑞氏-吉姆薩染色后分為4類，即無顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、中顆粒細(xì)胞以及大顆粒細(xì)胞。洪宇航等[10]和周凱等[12]根據(jù)顯微觀察及染色特征等分別將中華絨螯蟹和鋸緣青蟹的血細(xì)胞分為無顆粒細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞、中顆粒細(xì)胞和大顆粒細(xì)胞4類，比例范圍與該研究觀察較為接近。Lv等[13]根據(jù)顯微觀察結(jié)果把中華絨螯蟹血細(xì)胞分為透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞及顆粒細(xì)胞3個大類，但各種細(xì)胞所占比例與同類研究不同，原因是其先把含有少量顆粒的細(xì)胞也劃入透明細(xì)胞類群，然后又參考瑞氏-吉姆薩染色結(jié)果將透明細(xì)胞類群進(jìn)一步分為3種亞型。該研究在顯微鏡觀察中未使用輔助染色，而是仔細(xì)將含有少量顆粒的細(xì)胞與無顆粒細(xì)胞區(qū)分開，從而把中華絨螯蟹血細(xì)胞劃分成4個類群，無顆粒及小顆粒細(xì)胞之和同Lv等[13]劃分的透明細(xì)胞類群均占各自血細(xì)胞總量的60%左右，中顆粒和大顆粒細(xì)胞也與其劃分的半顆粒及顆粒細(xì)胞比例范圍接近，均占比20%左右。目前對于甲殼動物血細(xì)胞內(nèi)可辨識顆粒特征的鑒別尚無統(tǒng)一的量化標(biāo)準(zhǔn)，因此不同的研究結(jié)果之間存在一定的差異；另一方面，觀察辨識的工作量十分巨大，這些原因都限制了人工“驗血”的規(guī)模應(yīng)用。

表2 該研究結(jié)果與已發(fā)表結(jié)果的對比

流式細(xì)胞儀是一種先進(jìn)的自動化設(shè)備，常用來進(jìn)行細(xì)胞的分類分析，Zhou等[15]和Thayappan等[16]根據(jù)常規(guī)流式細(xì)胞儀的測量結(jié)果將擬穴青蟹和鼠蟬蟹(Emeritaemeritus)的血細(xì)胞劃分為透明細(xì)胞、半顆粒細(xì)胞及顆粒細(xì)胞3個類群，冼建安等[17-19]利用流式細(xì)胞儀從克氏原螯蝦、羅氏沼蝦和雜色鮑血細(xì)胞中分辨出透明細(xì)胞、小顆粒細(xì)胞及大顆粒細(xì)胞3個類群。基于常規(guī)流式細(xì)胞儀檢測，通常可將甲殼動物血細(xì)胞分為3個類群，但各個類群之間的界限不甚清晰，加之邊界細(xì)胞的形態(tài)及內(nèi)部特征等狀況需要收集檢測后方可確定，進(jìn)一步加大了精確分群的難度，因此采用常規(guī)流式細(xì)胞儀開展甲殼動物血細(xì)胞自動化分析的應(yīng)用尚不多見。該研究所采用的圖像輔助的新型流式細(xì)胞儀，亦被稱為多維全景分析儀，升級了測量模塊，增加了測量參數(shù)，因此可以較以往的流式分析獲得更為精確的測量數(shù)據(jù)和更加全面的測量維度。該研究結(jié)果也證實了這一點，不但清晰地分辨出了4個細(xì)胞類群，并進(jìn)一步通過圖像佐證確保分群結(jié)果的準(zhǔn)確性，而且還避免了收集邊界細(xì)胞再檢測等繁瑣的操作。與高等動物的血細(xì)胞類似，甲殼動物的血細(xì)胞遍布全身，是免疫系統(tǒng)的重要組分，因此一直都是關(guān)注的焦點。很多研究采用各種方法對其分類和功能開展了大量分析，但由于分類依據(jù)尚未統(tǒng)一以及量化標(biāo)準(zhǔn)還沒建立，因此各種分類結(jié)果及功能分析之間既有聯(lián)系又存在一定的差異。該研究利用新型的檢測儀器建立了一種區(qū)分度高且便于量化操作的自動化方法，并從中華絨螯蟹血淋巴中清晰地鑒別出4個類群的細(xì)胞，同步采集的圖像進(jìn)一步驗證了分群結(jié)果的準(zhǔn)確性，另一方面，每分鐘數(shù)萬樣本的高通量既提高了結(jié)果的可靠性，同時又極大地減少了人工操作強(qiáng)度。

哺乳動物血細(xì)胞最初僅能分辨紅細(xì)胞與白細(xì)胞2個類群，現(xiàn)階段利用各種新型的檢測技術(shù)以及白細(xì)胞的分化抗原等進(jìn)行更加細(xì)致的甄別，便不斷有新的細(xì)胞類型及功能特征被發(fā)現(xiàn)。對甲殼動物血細(xì)胞來說，基于不同方法鑒別的細(xì)胞類群的特征和比例既有聯(lián)系又有差異，表明還有很多特征及功能尚未被發(fā)現(xiàn)。晉偉等[20]提出應(yīng)將圖像輔助流式細(xì)胞儀等新型檢測手段應(yīng)用于水生動物血細(xì)胞分析，并加快檢測專用抗體的開發(fā)，以從基礎(chǔ)上促進(jìn)自動化“驗血”技術(shù)在水生動物中的廣泛應(yīng)用。參考哺乳動物血細(xì)胞的研究歷程有理由推斷，隨著研究技術(shù)的進(jìn)展、檢測水平的提高和分析維度的增加，特別是針對甲殼動物血細(xì)胞表面分子的各種商業(yè)化抗體的篩選以及抗體組研究的進(jìn)步，必將有更多的細(xì)胞類型和更精細(xì)的功能差異被逐步發(fā)現(xiàn)，從而促進(jìn)對甲殼動物血細(xì)胞功能的全面系統(tǒng)解析。