實時熒光定量PCR檢測柑橘黃龍病田間試驗藥劑防治效果

唐利華，郭堂勛，李其利，黃穗萍，莫賤友

(廣西農業科學院植物保護研究所/廣西作物病蟲害生物學重點實驗室，廣西南寧 530007)

柑橘黃龍病(citrus huanglongbing，HLB)是世界范圍內流行的毀滅性柑橘病害[1-2]，其顯著特征是引起柑橘葉片黃化和果實變綠，即為“青果”或“紅鼻子果”，該病害對東南亞、非洲以及中國、印度、巴西、美國佛羅里達和加利福尼亞等國家(地區)柑橘生產均造成嚴重的經濟損失[3-5]。柑橘黃龍病的病原菌為局限于韌皮部的革蘭氏陰性細菌，分為亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus，Las)、美洲種(Ca. americanus，Lam)和非洲種(Ca. africanus，Laf)，亞洲種是我國柑橘黃龍病的主要病原[6]，在全世界分布最為普遍，除了非洲地區，在其他有黃龍病發生的國家均有發現[7]。目前尚無防治柑橘黃龍病的特效藥劑和抗病品種，防控木虱、挖除病樹和種植無病苗木是防控柑橘黃龍病的三大核心措施[8]，柑橘黃龍病防控藥劑篩選研究也一直在進行[9]。越來越多的研究者通過熒光定量PCR技術追蹤檢測柑橘植株體內黃龍病菌的含量，以評估防控藥劑對柑橘黃龍病的防控效果，熒光定量PCR檢測柑橘黃龍病病原的靈敏度是常規PCR的100～1 000倍，是巢式PCR的10倍，其特異性好、靈敏度高[10-12]。筆者采用實時熒光定量PCR檢測柑橘黃龍病田間試驗藥劑橘葉青的防控效果，以期進一步促進柑橘黃龍病的田間防控。

1 材料與方法

1.1材料田間試驗藥劑：橘葉青(美國布朗特公司研制)；柑橘品種：南豐蜜橘；檢測組織：南豐蜜橘的葉片和果皮；檢測技術：實時熒光定量PCR。

1.2方法

1.2.1噴施地點、時間和方法。選取南寧市武鳴區陸斡鎮南豐蜜橘為試驗對象，試驗面積1.33 hm2，將橘葉青配制成30～36倍液，以噴霧的方式噴施植株，第1次噴施時間為2017年4月28日，第2次噴施時間為2017年7月27日。

1.2.2田間取樣時間和方法。第2次噴施橘葉青90 d之后(即2017年11月3日)采集葉片和果實樣品。隨機選取5株不噴施橘葉青的對照植株和5株噴施橘葉青的處理植株，每株樹隨機采集1個葉片組織樣品和1個果實樣品。對照葉片組織檢測編號對應為D1、D2、D3、D4、D5；處理葉片組織檢測編號對應為E1、E2、E3、E4、E5；對照果皮組織檢測編號對應為F1、F2、F3、F4、F5；處理果皮組織檢測編號對應為G1、G2、G3、G4、G5。

1.2.3檢測取樣方法。取葉片組織中脈0.1 g，果皮0.2 g用于DNA提取，注意取樣時不同樣品勿互串污染。標準品：濃度為24 ng/μL，將標準品10倍梯度稀釋，分別稀釋10～105倍5個梯度作為模板和待測樣品同批上機檢測。

1.2.4實時熒光定量PCR反應體系(20.0 μL)。Premix ExTaq(2×,TaKaRa) 10.0 μL、引物HLBas(10 μmol/L)0.5 μL、引物HLBr(10 μmol/L)0.5 μL、探針HLBp(10 μmol/L)0.5 μL、ddH2O 7.5 μL、模板1.0 μL。每個樣品設置3個重復，加樣時避免交叉污染，陰性對照最后加樣。引物和探針設計參考Li等[13]。

1.2.5實時熒光定量PCR反應條件。預變性 95 ℃ 30 s、變性95 ℃ 5 s、退火/延伸 60 ℃ 30 s，第2步至第3步40個循環。

2 結果與分析

從葉片組織病原菌含量檢測結果看，每個樣品的循環數值(Ct)重復性非常好，對照、處理的重復樣品之間病原菌拷貝數差異較大，在葉片組織檢測結果中對照樣品D1拷貝數為584 748.55拷貝/μL，D5拷貝數為259.26拷貝/μL，相差約2 254倍，處理樣品E3拷貝數為13 149.43拷貝/μL，E2拷貝數為193.26拷貝/μL，相差約67倍。在果皮組織檢測結果中對照樣品F3拷貝數為855 151.54拷貝/μL，F2拷貝數為248.82拷貝/μL，相差約3 435倍，處理樣品G2拷貝數為134 856.85拷貝/μL，G1拷貝數為105.42拷貝/μL，相差約1 278倍。

因樣品為田間隨機取樣，病原菌的不均勻分布造成葉片、果皮組織帶菌量存在較大差異屬于正常現象，但對照樣品帶菌量總體比噴施橘葉青后的樣品帶菌量高，葉片組織中對照樣品平均拷貝數為125 882.69 拷貝/μL，處理樣品平均拷貝數為3 492.24拷貝/μL，含菌量降低近35倍；果皮組織中對照樣品平均拷貝數為211 212.88 拷貝/μL，橘葉青處理樣品平均拷貝數為27 300.69拷貝/μL，含菌量降低約7倍(表1、2)。以上結果表明橘葉青對柑橘黃龍病具有一定的抑制作用，可以有效控制病原菌在柑橘植株中的發生。

表1 葉片組織病原菌含量檢測結果

表2 果皮組織病原菌含量檢測結果

3 討論

從整體而言，防控木虱、挖除病樹和種植無病苗木是防控柑橘黃龍病三大核心措施，可降低整個田間生態中柑橘黃龍病病原含量，就植株個體而言，一些防控技術措施可降低植株個體內含菌量，抑制還未呈明顯癥狀的帶毒植株中病原菌的擴展，目的一樣，只是針對的范圍、環境不同。該試驗中熒光定量PCR檢測結果顯示同處理不同樣品之間含菌量差異較大，是因為病原菌在組織中存在分布不均勻的現象，前人研究證明了這一點。Kawabe 等[14]通過熒光定量 PCR 比較分析了感黃龍病植株不同樣品、不同組織的含菌量差異，發現柑橘葉柄、葉中脈的病原菌含量較高，樹皮稍低，而樹根最低。劉曉露[15]從田間感黃龍病沙糖橘植株上采集不同部位的葉片樣品，利用探針法熒光定量PCR技術檢測Las的濃度，結果發現在表現黃龍病癥狀的枝條上，老葉病原菌濃度最低，嫩葉稍高，成熟葉片中的濃度最高。另外，實時熒光定量PCR檢測結果表明藥劑橘葉青對柑橘黃龍病具有較好的防控效果，噴施2次之后降低了柑橘帶菌量，可以有效控制病原菌在組織內增殖，因此該藥劑可進一步作為田間防控藥劑進行試驗。