2016～2017年遼寧地區豬圓環病毒2型分子流行病學調查及全基因組進化分析

梁 喬，張 健 ，申貫男，王宏燕，關 淼，楊洺揚，李 蓉

（1.遼寧省動物疫病預防控制中心，遼寧 沈陽 110164；2.遼寧省動物醫學研究院，遼寧 沈陽 110164）

豬圓環病毒（porcine circovirus，PCV）隸屬圓環病毒科，在1974年被當作豬腎細胞中的一種污染物被發現，PCV1和PCV2是PCV的兩種血清型，PCV1不具有致病性，在正常豬或養殖野豬身上均可存在，PCV2有致病性，是斷奶仔豬多系統衰竭綜合征（Post-weaning multisystemic wasting syndrome，PMWS）的原發病原[1-3]。自從PCV2在1998年被發現后，這種具有有限的編碼能力的單鏈DNA病毒便被作為重要的豬流行病病原之一[4]，該病毒的長度是1.7 kb左右，嚴重的PCV2感染引起的典型特征是腹股溝淋巴結腫大。PCV2基因組中有一個高度保守的莖環結構，在單鏈DNA病毒中感染真核生物[5]。通過不同基因型的患病率調查顯示，PCV2具有較高的變異性，目前已確定的是5種基因型從PCV2a-PCV2e，其中PCV2b和PCV2d是檢出最多的兩種基因型[6]。

本研究通過對2016年遼寧省14個市采集的1 580份屠宰場樣本和2017年采集的1 850份屠宰場樣本進行熒光定量PCR檢測，分析PCV2在遼寧地區的流行情況，并對7株PCV2分離株進行全基因組擴增并通過測序進行生物信息學分析。

1 材料與方法

1.1 樣品來源采集屠宰場豬組織樣品，主要包括頜下淋巴結、肝臟、肺臟、脾臟、扁桃體等。

1.2 主要試劑病毒核酸提取試劑盒（磁珠法），購自蘇州天隆生物科技有限公司；豬圓環病毒2型熒光PCR檢測試劑盒（TaqMan探針法），購自中山大學達安基因股份有限公司。EX Taq DNA聚合酶（5 U/μL）、dNTP（2.5 mmol/L）、溴化乙錠、DL 2000 DNA Marker、三羥甲基氨基甲烷一乙酸電泳緩沖液購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病料DNA的提取

1.3.1 用無菌鑷剪夾取待檢樣品2.0 g于1.5 mL滅菌離心管中，加入適量生理鹽水后將離心管放入組織研磨器中固定好，3 000 r/min離心5 min，然后將離心管放入臺式高速冷凍離心機3 000 r/min離心10 min，將上清液吸入1.5 mL離心管中，同時做好樣品對應的標記。

1.3.2 向蛋白酶K干粉中注入1.4 mL蛋白酶K稀釋液后充分混勻備用，向96孔板中的第1列和第7列分別加入20 μL蛋白酶K和200 μL樣本。

1.4 病料樣品檢測和PCV 2全基因的擴增

1.4.1 病料樣品檢測50℃2 min，95℃15 min，循環設置：94℃15 s→55℃45 s（在第40個循環處進行熒光的收集）。

1.4.2 PCV2全基因的擴增擴增PCV2全基因引物由上海生工合成，上游引物為：5’-GTACCTTGTTGGAGCGGG-3’；下游引物為：5’-TCACA GCAGACAGGTCA-3’。檢測引物PCR反應條件：94℃4 min，94℃50 s，56℃50 s，72℃1 min，35個循環，72℃10 min，PCR產物4℃保存。

1.4.3 PCV2全基因生物信息學分析 采用DNAStar軟件及Clustal W對測得的PCV2全基因序列進行拼接和比對，利用Mega軟件構建系統進化樹，進一步從PCV2的分子遺傳層面進行研究分析。

2 結果與分析

2.1 PCV 2的感染情況對2016～2017年遼寧省14個市豬場采集的病料進行檢測，其中2016年為1 580份，2017年為1 850份，結果表明PCV2感染率分別為83.54%、85.62%。具體見表1和表2。

2.2 常規PCR檢測結果通過全基因引物進行PCR擴增，在1 700 bp附近出現目的片段，將PCR產物送上海生工進行測序后，證實所分離的毒株是PCV2。檢測結果如圖1。

2.3 PCV 2的全基因擴增結果及進化分析從病料樣品中共獲得7株PCV2的全基因序列，與GenBank中公布的不同類型（PCV2a-PCV2d）的參考毒株對比分析結果如圖2。本研究分離到的7株PCV2毒株之間基因核酸序列同源性為93.9%～100%，與國內外20株PCV2代表毒株基因核酸序列進行同源性比較分析發現，與9株國外代表毒株基因核酸序列同源性為93.7%～99.6%，與11株國內其他地區代表毒株之間的同源性為92.9～99.4%。與國外代表毒株相比，與美國地區PCV2代表毒株（JX535296）基因核酸序列同源性高達99.6%，與丹麥地區PCV2代表毒株（EU148503～505）基因核酸序列同源性最低為93.1%～95.1%，與國內代表毒株相比，與同處于東北地區的黑龍江地區PCV2毒株（HM038017）基因核酸序列同源性相對較高為94.7%～99.7%，與臺灣地區PCV2毒株（AF364094）同源性相對較低為93.3%～94.3%，根據Olvera提出的分型標準，根據系統進化樹的遺傳演化分析結果如圖3，7株遼寧地區PCV2毒株中有4株屬于PCV2d基因型，2株屬于PCV2a基因型，1株屬于PCV2b基因型。與代表毒株相比，4株PCV2d基因型與國內廣西（KJ956689）、上海毒株（KF850049）的同源性比較近，2株PCV2a基因與臺灣毒株（AF364094）的同源性比較近，1株PCV2b基因型與國內廣西毒株（KJ956689）的同源性比較近。

表1 遼寧地區不同地區PCV2病原學陽性率Table 1 The positive rates of PCV2 in different areas of Liaoning

表 2 遼寧地區不同季節PCV2病原學陽性率Table 2 The positive rates of PCV2 in different quarters of a year in Liaoning

圖 1 PCV2全基因檢測結果Fig.1 The result of PCR samples

3 討論

通過對2016～2017年遼寧地區14個市共3 430份豬屠宰場組織樣本的檢測可知，遼寧地區的PCV2的感染率很高，據報道世界各地PCV2的感染率都很高，且傳播與變異較快，這與萬青山[6]、曹正等[7]、梁鵬帥[8]的研究結果一致，從地域分布上來看，兩年間遼西地區病原學陽性率都屬最高，分別為90.26%、87.80%，遼中地區病原學陽性率相對偏低；分析原因可能是遼西養殖業較多、疫病傳播速度快，還有遼西與其他省份毗鄰，也為疫病的傳播提供了地理優勢。

圖 2 PCV2全基因序列同源性比對Fig.2 Complete genome nucleotide sequence homology comparison of PCV2

圖 3 基于PCV2全基因序列的系統進化樹Fig.3 Complete genome nucleotide sequence phylogenetic tree of PCV2

從時間分布上來看，春季和夏季的病原學陽性率要高于秋季和冬季。分析原因可能是由于氣溫較高有助于疾病的感染和傳播。豬群飼養密度、豬只的移動和混群、防疫條件等都能增加疾病的感染率，造成該病的擴散和傳播。

遺傳演化分析表明，遼寧地區PCV2的優勢基因型主要是PCV2a、PCV2b、PCV2d，其中PCV2d屬于PCV2b的突變體也稱mPCV2b，是預防感染PCV2b的病毒性疫苗被大規模引進后產生的基因型，在中國和韓國有逐漸替代PCV2b成為主要的基因型趨勢，PCV2d也成為第二個主要的基因型。突變的主要部位是ORF2閱讀框，ORF2的大小是705 bp，編碼了234個氨基酸，要比普通的PCV2多一個氨基酸（普通的為233個氨基酸），ORF2閱讀框3’端原本的TAA終止密碼子變成了AAG（Lys），因此多出一個氨基酸。PCV2b是在PCV2疫苗免疫失敗發生PMWS的情況下發現的，因此也被懷疑這種新的突變體產生了抗原漂移，從而導致疫苗免疫失敗[9-11]。

通過對遼寧地區PCV2的分子流行病學調查，發現PCV2感染率極高并呈上升趨勢，提示亟需高效的PCV2疫苗來實施免疫并盡量減少毒力反強等現象的發生。從分子水平分析研究毒株之間的差異，明確了該地區近幾年的PCV2的毒株的基因亞型及變異趨勢，另外近幾年PCV3的出現對于今后研究的方向也具有一定的指導意義。