HPLC法測定中獸藥散劑中非法添加的10種磺胺類藥物

田曉玲

(遼寧省獸藥飼料畜產品質量安全檢測中心，遼寧 沈陽 110016)

磺胺類藥物（Sulfonamides）是以對氨基苯磺酰胺為基本結構的衍生物，新型藥物發展迅速，逐漸形成以短效、中效和長效分類的系列抗菌藥物，并以療效確切、性質穩定、價格低廉、使用方便等優勢成為最廣泛的臨床用藥之一。但由于磺胺類藥物能發生過敏反應，對泌尿系統有損害，長期使用而耐藥等副作用以及在動物抗感染治療中不規范的使用，造成動物性食品中的殘留對人類和環境的危害和污染。歐盟、美國等發達國家及我國都規定了磺胺類藥物在動物性食品中的最高殘留限量，并被列入動物食品中重點監控的藥物之一。一些非法企業為謀求藥效，會在中獸藥散劑中添加磺胺類藥物，造成動物性食品藥殘超標，嚴重威脅人類健康。檢測獸藥中非法添加物常用的方法有高效液相色譜法（HPLC）法和液質聯用（LC-MS/MS）法[1-3]，但因串聯質譜儀要求條件較高，價格昂貴，使普及應用受到限制。但現有的HPLC法同時檢測的磺胺類藥物較少[4-6]，在實際檢測中效率不高。本研究針對獸藥中非法添加的中國獸藥典收載及獸醫臨床應用較多的10種磺胺類藥物進行了HPLC方法研究，為同時檢測非法添加的多種磺胺類藥物提供一種靈敏、快速、低成本、高通量的新方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器Waters 2695高效液相色譜儀，Waters公司；AE260電子天平，Mettler-toledo公司；KQ-250超聲波清洗器，昆山超聲波儀器有限公司。

1.2 藥品和試劑 磺胺嘧啶（批號100026-201404，純度99.7%），磺胺間甲氧嘧啶（批號510093-201401，純度97.5%），購自中國食品藥品檢定研究院；磺胺氯吡嗪（批號H0281308），購自中國獸醫藥品監察所；磺胺醋酰（批號107118，純度99.0%）、磺胺吡啶（批號101168，純度99.0%）、磺胺二甲基嘧啶（批號91440，純度99.0%）、磺胺氯噠嗪（批號G119228，純度99.1%）、磺胺甲惡唑（批號121573，純度99.0%）、磺胺二甲氧嘧啶（批號40903，純度99.5%）、磺胺喹噁啉（批號41219，純度99.0%），均購自德國Dr Ehrenstorfer公司；乙腈、甲醇為色譜純，FISHER公司；乙酸為分析純；水為超純水。

2 試驗方法

2.1 色譜條件 色譜柱為C18柱，150 mm×4.6 mm（i.d.）,粒徑5 μm；流動相：乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）；柱溫：30℃；流速：1.0 mL/min；檢測波長：270 nm；進樣量為10 μL。10種磺胺類藥物在該條件下的色譜圖見圖1。

圖110 種磺胺類藥物標準溶液色譜圖Fig.1 Chromatogram of 10 sulfonamides reference

2.2 標準溶液的制備 分別精密稱取10種對照品適量，置于容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋成濃度為1 mg/mL的標準儲備液。

2.3 標準曲線繪制 精密量取適量標準儲備液，用甲醇稀釋成濃度均為50、100、200、400、800 ng/mL的系列混合對照溶液，由低濃度到高濃度進樣，外標法定量，峰面積為縱坐標，對應濃度為橫坐標，進行回歸，計算回歸方程和相關系數。

2.4 供試品溶液的制備 取樣品1.00±0.05 g于100 mL容量瓶中，甲醇定容，超聲30 min，濾膜過濾后，供液相色譜儀測定。

2.5 檢測限的測定 將適當濃度的10種磺胺類藥物加入到空白中藥制劑中，制成2、5、10、20 mg/g 4個濃度的添加樣品，經上述方法前處理后，用HPLC檢測，觀察藥物色譜峰信噪比（S/N）和對應藥物濃度，S/N大于3者，定其為檢測限。

2.6 準確度和精密度的測定 采用標準添加法，在空白制劑中（止痢散）添加5、10、20 mg/g 3個不同濃度進行回收率試驗，每一濃度進行5個平行試驗，分別考察3個批次，分別計算回收率和批內、批間精密度。

3 結果與討論

3.1 線性范圍10種磺胺類藥物在50～800 ng/mL范圍內線性關系良好，回歸方程和相關系數見表1。密度見表2，止痢散添加標準品色譜圖見圖2。

表110 種磺胺類回歸方程和相關系數Table 1 The regression equation and correlation coefficient of 10 sulfonamides

3.3 檢測限 按2.5方法進行處理，當添加濃度為5 μg/g時，測得10種磺胺類藥物S/N大于3，表明方法檢測限為5 μg/g。

表2 止痢散添加回收率Table 2 Recovery of 10 sulfonamides from Zhili San

3.2 準確度和精密度10種磺胺類藥物在5、10、20 mg/g 3個濃度添加水平的回收率及批內、批間精

圖2 空白止痢散中添加10種磺胺類藥物的色譜圖Fig.2 Chromatograms for Zhili San spiked with 10 sulfonamides

3.4 色譜條件的優化 采用HPLC法進行多種磺胺類藥物檢測，鑒于多組分分離困難。本試驗先后選取了乙腈-0.017 mol/L磷酸（80+20）、乙腈-甲醇-2%乙酸混合溶液梯度洗脫、乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+15+70）、乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）作為流動相，結果發現乙腈-甲醇-2%乙酸溶液（15+5+80）既能實現10種磺胺類藥物的良好分離，又能排除中獸藥的其他雜質的干擾，方法簡便、穩定，可操作性強。

3.5 提取條件選擇 磺胺類藥物常用的提取方法包括用純有機溶劑（甲醇、三氯甲烷、乙酸乙酯等），或用有機溶劑添加一定比例水進行提取。本方法采用甲醇溶液作為提溶劑，簡便快速，回收率滿足有關要求。