雞源致病性奇異變形桿菌分離鑒定及藥敏試驗

何欣怡，徐 睿，任 麗，唐 強

（西昌學院動物科學院，四川 西昌 615000）

奇異變形桿菌為革蘭氏陰性菌，無芽胞、無莢膜、周身鞭毛、形態成明顯多形性，其生長繁殖對營養要求不高，4～7℃即可繁殖。該菌廣泛存在于人與動物糞便、污水、土壤及臨床標本中，其產生的毒素可以引起中毒，是一種常見的條件致病菌。奇異變形桿菌不僅感染雞、鴿、山羊、奶牛和豬等常見家畜，也可感染猴、狐貍、熊貓和水貂等動物，在動物機體體抗力下降時能夠引起外科感染、泌尿系統感染、腹瀉和菌血癥等[1-8]。近年來，我國河南、河北、山東、安徽、廣西等地不斷有雞群暴發奇異變形桿菌病，尤其是在季節更替、環境變化、轉群和混合感染其他病原時，雞群體抗力下降，病情加重，病死率升高，給畜禽養殖帶來較大的經濟損失[9-10]。

本試驗通過對西昌市月華鄉、興勝鄉、太和鎮、德昌縣王所鄉雞場樣品進行奇異變形桿菌的分離鑒定、藥敏試驗和致病力試驗，證明該病原菌為奇異變形桿菌，且篩選出敏感藥物，為污染控制、疾病防治提供了試驗依據。

1 試驗材料

1.1 主要試劑 營養肉湯、營養瓊脂均購置于青島高科園海博生物技術有限公司；麥康凱瓊脂培養基、水解酪蛋白瓊脂、藥敏紙片均購置于杭州微生物試劑有限公司；DL 2000 DNA Marker、2×Tap PCR Master Mix、細菌基因組DNA提取試劑盒均購置于天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 主要儀器 超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）、基因擴增儀（珠海黑馬醫學儀器有限公司）、DYY-6C型電泳儀電源（北京市六一儀器廠）、水平電泳槽（北京市六一儀器廠）、切膠儀（天根生化科技（北京）有限公司）等。

1.3 試驗動物3日齡健康雛雞100只。

2 試驗方法

2.1 病料的采集 在西昌市月華鄉、興勝鄉、太和鎮、德昌縣王所鄉雞場對疑似奇異變形桿菌病的死雞進行病理解剖，觀察其內部器官，并對其出現病變的部位如肝臟、腸道、脾臟等器官進行病料采集，帶回實驗室備用。

2.2 細菌的分離培養 在無菌的條件下，將病變組織新鮮切面觸壓于普通營養瓊脂平板，37℃恒溫恒濕培養16～18 h，挑選單個典型菌落進行革蘭氏染色及鏡檢。然后再將其接種于麥康凱瓊脂平板，伊紅美藍瓊脂平板，血平板，37℃培養16～18 h，觀察菌落在平板上的生長情況及溶血特征，挑取單個典型菌落進行革蘭氏染色后鏡檢，同時挑取單個菌落接種于營養肉湯培養基37℃180 r/min，震蕩培養16～18 h，4℃存放備用。

2.3 分子生物學鑒定

2.3.1 引物設計 通過GenBank中已發表的序列，奇異變形桿菌16S rRNA通用引物。上游引物B27-F：AGAGTTTGATCCTGGCTCAG，下游引物B-1492R：TACGGYTACCTTGTTACGACTT，由上海杰李生物技術有限公司合成。

2.3.2 細菌DNA的制備 按照細菌基因組DNA試劑盒的步驟對純化細菌進行DNA提取。細菌DNA于-20℃存放。

2.3.3 16S rRNA核苷酸序列擴增PCR 25 μL反應體系：上游引物B27-F：0.5 μL，下游引物B-1492R：0.5 μL，2×Tap PCR Master Mix：12.5 μL，ddH2O：9.5 μL，模板DNA：2 μL。

PCR反應程序：94℃預變性5 min；94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸50 s，35個循環；72℃延伸5 min。反應產物-20℃存放。

2.3.4 瓊脂糖凝膠電泳16S rRNA核苷酸序列擴增完成后，取10 μL PCR產物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測，并置于SDS-PAGE凝膠成像系統成像，觀察條帶的亮度及初略大小，切下瓊脂糖凝膠中目的條帶，送往上海杰李生物技術有限公司測序。

2.3.5 序列分析 測序后，利用NCBI網站中Blast檢索系統對測序得到的16S rRNA基因序列進行同源性分析，確定菌株的類型。

2.4 藥敏試驗 使用kirby-bauer（K-B）紙片法進行試驗，然后根據美國臨床標準委員會（NCCLS）標準將其分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。

2.5 雛雞致病力試驗 將100只3日齡的健康雛雞隨機分成20組，每組5只。1～18組為試驗組，19組為試驗對照組，20組為空白對照組，試驗組菌液用滅菌肉湯稀釋到渾濁度與1.0個麥氏單位渾濁度一致（菌液濃度約為3×108cfu/mL），具體處理方案（如表1）處理后，每隔12 h觀察并記錄1次雛雞的精神狀況及死亡情況，并對死亡雛雞進行病理解剖，無菌采集心臟、脾臟、肝臟等病變器官及組織，然后分離培養及鑒定，完成菌株的回收。

表1 處理方案Table 1 Plan to deal with

3 結果與分析

3.1 細菌的分離培養 營養瓊脂上形成乳白色中等大小菌落，菌落邊緣整齊，有明顯遷徙生長現象，散發特殊的腐敗性氣味；麥康凱瓊脂形成淡紅色圓形扁平菌落，表面光滑濕潤；鮮血平板上呈無色菌落。鏡檢結果為的革蘭氏陰性細菌，以桿狀為主，菌體多兩端鈍圓。詳見圖1～4。

3.2 分子學鑒定結果 經16S rRNA基因PCR擴增后，用SDS-PAGE凝膠成像系統成像，擴增得到的相應目的條帶在1 000～2 000 bp之間，與預期條帶大小初略一致，詳見圖5。經上海杰李生物技術有限公司測序后，利用NCBI網站中Blast檢索系統對測序得到的16S rRNA基因序列進行同源性分析，結果表明擴增序列與GenBank上其他奇異變形桿菌的核苷酸同源性達到99%以上。

圖1 營養瓊脂平板Fig.1 General Nutrition Tablets

圖2 麥康凱平板Fig.2 MacConkey Tablet

圖3 鮮血平板Fig.3 Blood plate

圖4 鏡檢Fig.4 Microscope inspection

3.3 藥敏試驗 隨機挑選3個不同養殖場共7株奇異變形桿菌對頭孢類、青霉素類、氨基糖苷類、氟喹諾酮類、大環內酯類及四環素類共6種類型抗生素進行藥敏試驗。根據美國臨床標準委員會（NCCLS）標準將其分為敏感（S）、中介（I）、耐藥（R）。藥敏具體情況見表2。

圖5 16S rRNA電泳圖Fig.5 Electropherogram of 16S rRNA

表2 奇異變形桿菌藥敏試驗結果Table 2 Results of drug test of Proteusmirabilis

試驗數據表明：7株奇異變形桿菌對頭孢一代藥物的耐藥率為71.4%；對頭孢二代藥物的耐藥率為71.4%；對頭孢三代藥物的耐藥率為14.2%～71.4%；對青霉素類藥物的耐藥率為14.2%～85.0%；對氨基糖苷類藥物的耐藥率為0.00%～42.8%；對氟喹諾酮類藥物的耐藥率為28.5%；對大環內酯類、四環素類藥物的耐藥率為100%。

3.4 雛雞致病力試驗 試驗組雛雞，先后表現不同程度的精神萎靡，食欲減退，羽毛蓬亂，站立不穩，且喜臥，并且少數雛雞死亡后還出現角弓反張（見圖5）等精神癥狀。試驗組的雛雞在12 h左右陸續出現死亡，死亡情況詳見表2。試驗對照組和空白對照組雛雞精神狀況良好。將死亡的雛雞進行病理解剖，發現主要病變有：脾臟、腎臟有不同程度的腫大；胸腺有出血點（見圖6）；膽囊腫大充盈；肝緣有淤血（見圖7）；腦膜有出血、充血（見圖8）。在無菌條件下，將死亡雛雞病變器官和組織用涂抹的方式接種于普通瓊脂平板上，分離純化、鑒定，回收到的菌株與注射的菌株一致。

圖 5 角弓反張Fig.5 Antagonist

圖 6 胸腺腫大Fig.6 Thymus enlargement

表 3 奇異變形桿菌的致病力試驗結果Table 3 Results of pathogenicity test of Proteusmirabilis

圖 7 肝臟淤血Fig.7 Hepatic congestion

圖 8 腦膜出血Fig.8 Meningeal Hemorrhage

4 討論

致病力試驗結果表明，18株奇異變形桿菌中有16株具有致死性，其中致死率高于60%有5株，有4株的致死率為40%，有7株的致死率為20%。奇異變形桿菌為條件致病菌，當其與宿主間的生態平衡在某些情況下被打破，就會形成生態失調，從而正常不致病的正常菌群就成為條件致病菌。細菌的寄生部位發生改變、機體免疫功能下降、菌群失調[11]都有可能打破這種平衡，從而導致疾病的發生。

藥敏試驗結果顯示，7株奇異變形桿菌都出現多重耐藥性，但因不同地區養殖場使用抗生素情況不同，其耐藥情況不完全一致。從總體上看，7株奇異變形桿菌都出現了嚴重的耐藥性，表現為同時對紅霉素、麥迪霉素、多西環素、米諾環素共4種抗生素耐藥，其中紅霉素、麥迪霉素、多西環素的抑菌圈直徑均為0。頭孢類藥物的耐藥率為14.2%～71.4%，明顯高于年華等[12]相同藥物5.4%～59.0%的耐藥率，可能由本地區用藥情況及耐藥菌株的不斷衍化造成。丁胺卡那在試驗中表現出高敏性，可作為治療該地區奇異變形桿菌病的首選藥物。

結合各采樣場實際情況，造成細菌多重耐藥的主要原因可能有以下幾點：①養殖場為了提高動物性能、改善飼料轉化率、預防疾病而在飼料中添加大劑量的抗生素；②在治療過程中盲目使用抗生素，或使用抗生素治療不徹底。

臨床上，應加大對畜禽舍消毒強度，并提高畜禽自身免疫力；在使用抗生素時，應嚴格掌握抗菌藥物的類型、劑量、給藥次數、給藥途徑、療程、聯合用藥及交叉用藥，避免出現超劑量使用、長期低劑量使用及無針對性用藥等濫用抗生素的現象。有條件最好先進行藥敏試驗，篩選出敏感藥物再進行治療。