HPV16E6及HPV16E7蛋白在宮頸癌中的表達及臨床意義

史 春，葛 菲，溫云花

宮頸癌為女性常見的生殖道惡性腫瘤，早期無特異性體征及癥狀，多表現為陰道排液及出血，病死率較高[1]。隨著宮頸癌篩查技術的進展，其發病率和病死率逐漸降低，盡早診治是改善患者生存質量及預后的關鍵[2]。多因素導致宮頸癌發生，既往研究證實[3]，高危型人乳頭瘤病毒(HPV)持續感染與宮頸癌的發生具有相關性，以HPV16型最常見，其可導致正常細胞化生，刺激HPV16E6、HPV16E7等致癌基因表達并整合至宿主染色體生成相關E6、E7蛋白，引起宿主細胞周期調節蛋白和癌蛋白互相結合，導致細胞周期的控制發生異常產生癌變，但其致癌機制仍未完全明確[4-5]。雖然目前國內外關于HPV16E6及HPV16E7蛋白表達強度的相關研究較多，但意見尚未達成一致[6]。本研究旨在探討HPV16E6、HPV16E7蛋白在宮頸癌中的表達及意義。現報告如下。

1 資料與方法

1.1一般資料 選取海口市婦幼保健院2016年1月—2017年10月收治的宮頸癌65例為A組。納入標準[7]：均經病理組織活檢證實為宮頸癌；病歷資料完整；無全子宮切除史；無自身免疫性病變。排除標準：新輔助放化療；全身系統明顯病變；近期伴陰道和宮頸手術治療史。年齡34～70(44.20±8.65)歲。同期確診的宮頸上皮內瘤樣病變(CIN)80例為B組，年齡31～71(43.10±9.41)歲。同期因子宮頸肌瘤行全子宮切除的正常宮頸患者35例為C組，年齡29～71(45.02±7.54)歲。3組年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。

1.2方法

1.2.1標本收集：手術收集相關病理組織，放置于液氮中并轉移至-80℃低溫箱中待用。

1.2.2HPV16E6及HPV16E7蛋白測定：選用免疫組化染色法(SP)進行，將標本組織制作為蠟塊并切片，脫蠟至水。于室溫下予以3%過氧化氫溶液浸泡15 min，采用蒸餾水沖洗，并予以PBS浸泡3次。將切片進行熱抗原修復，給予PBS液沖洗3次，并滴加5% BSA以封閉，于室溫環境下孵育20 min，并加入對應的一抗工作液，于4℃冰箱中放置過夜。次日取出標本，于室溫環境下放置0.5 h，予以PBS液沖洗3次，并加入生物素以標記二抗工作液，于37℃環境下孵育0.5 h。予以PBS沖洗3次，加入鏈霉親和素復合體，于37℃環境中孵育20 min ，并取PBS沖洗3次。再滴加DAB染色，并予以蘇木素復染，常規酒精脫水、透明并封片，于顯微鏡下查看染色情況，并控制反應時間，以終止反應。取自來水沖洗，予以復染、脫水、透明并封片。以PBS代替一抗為空白對照，作為質量控制標準。在光學顯微鏡持續觀察10個高倍視野，計算細胞核或者細胞質呈棕黃色陽性細胞，陽性細胞數>10%判定為陽性[8]。

1.2.3臨床病理特征觀察：自行設計觀察表，核對入組患者年齡、組織類型、組織學分級、臨床分期、腫瘤直徑、淋巴結轉移及浸潤等情況。

2 結果

2.1HPV16E6及HPV16E7蛋白在正常宮頸、CIN和宮頸癌中表達比較 HPV16E6在正常宮頸中著色位于胞膜，無細胞核染色，在宮頸癌細胞質中可見棕黃色陽性細胞；HPV16E7著色位于胞膜，無細胞核染色，其在宮頸癌細胞膜的表達出現減弱或缺失，并且出現細胞質表達，且呈棕黃色。A組HPV16E6及HPV16E7蛋白陽性表達率明顯B組和C組(P<0.05)。見圖1、2及表1。

2.2HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和宮頸癌臨床病理特征的關系分析 HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和年齡、宮頸癌組織學分級、腫瘤直徑、淋巴結轉移無關(P>0.05)；HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和宮頸癌組織類型、臨床分期及脈管或者宮旁浸潤相關(P<0.05)。見表2。

表1 HPV16E6及HPV16E7蛋白在正常宮頸、宮頸上皮內瘤樣病變和宮頸癌中的表達[例(%)]

注：A組為宮頸癌，B組為宮頸上皮內瘤樣病變,C組為正常宮頸；與C組比較；aP<0.05；與B組比較；cP<0.05

2.3宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白表達相關性分析 宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白呈正相關(r=0.539，P<0.001)。見表3。

表2 HPV16E6及HPV16E7蛋白表達和宮頸癌臨床病理特征的關系[例(%)]

表3 宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白表達的相關性

3 討論

宮頸癌發病機制復雜，為多分子及多基因水平改變，可引起系列癌基因細胞周期調控改變及傳導通路異常。臨床研究表明，HPV感染為宮頸癌致病的主要誘因，其作為一種雙鏈DNA病毒，在CIN及宮頸癌發生中起到重要作用[9-10]。近年來，隨著下生殖道疾病和HPV感染研究的不斷深入，發現HPV16為HPV高危型的主要類型[11]。HPV16嗜組織性及種屬特異性明顯，可危及黏膜及皮膚鱗狀上皮，其中HPV16E6及HPV16E7蛋白能和多種分子蛋白相互作用，導致細胞發生無限增殖與惡性轉變，共同起到致癌作用[12]。

HPV16E6蛋白作為一種多功能蛋白，其鋅指結果和惡性轉化有著緊密聯系，P53作為一種主要抑癌基因，HPV16E6能影響P53對相關信號的轉錄，促進P53降解，導致P53抑制細胞生長增殖作用減弱甚至消失，引起癌變[13]。HPV16E6可刺激血管內皮生長因子表達，誘導腫瘤細胞轉移，同時能增加外源性DNA整合與誘變[14]。研究證實[15]，宮頸癌及宮頸異型增生與端粒酶激活相關，HPV16E6能引起高端粒酶反轉錄酶mRNA水平上升，刺激端粒酶表達，導致正常細胞永生化，為CIN轉化至宮頸癌的關鍵步驟，其陽性表達率可隨宮頸癌的不斷進展而相應增加。HPV16E7蛋白多位于宿主細胞核內分布，也具有鋅指結構，其22～226位氨基酸為pRb蛋白結合位點，若pRb位點異常能夠影響細胞周期相關調控[16]。機體感染HPV16后能夠引起非磷酸化pRb蛋白與HPV16E7結合，調節G1期與S期基因轉錄。李玲等[17]研究表明，HPV16感染后的HPV16E6及 HPV16E7蛋白一起參與惡性腫瘤發生，其中HPV16E6能提高HPV16E7蛋白的致癌能力，二者共同表達容易進展至惡性腫瘤。近期研究發現[18-19]，HPV16E6及HPV16E7可能為宮頸癌發病的獨立危險因素。本研究顯示，宮頸癌組織中HPV16E6及HPV16E7蛋白陽性表達率明顯高于CIN及正常組織，說明二者表達上調導致宮頸癌發生的主要誘因，證實HPV感染和宮頸癌發生有著良好相關性，進一步支持研究結果。

研究報道[20]，與HPV16感染相關的惡性腫瘤及鱗狀上皮內病變中HPV16E6及 HPV16E7蛋白表達明顯上調，說明其水平改變和細胞惡性轉化及病變進展有良好相關性。本研究進一步分析HPV16E6及HPV16E7蛋白表達和臨床病理聯系可見，HPV16E6及HPV16E7蛋白的表達和組織類型、臨床分期、脈管或者宮旁浸潤相關，說明其可一定程度的反映宮頸癌組織類型及浸潤情況，預測腫瘤惡性程度，可能和HPV16能夠誘導癌旁組織淋巴管及新生血管形成，從而促進腫瘤侵襲，增加惡性程度有關，但本研究未發現HPV16E6及HPV16E7蛋白的陽性表達和年齡、宮頸癌組織學分級、腫瘤直徑等相關性，可能為本研究樣本數較少，存在一定的抽樣誤差，有待更多累計實驗考察。同時本結果顯示，宮頸癌組織中HPV16E6和HPV16E7蛋白呈正相關，證實二者之間有著良好的相關性，共同參與宮頸癌的病變。

綜上所述，HPV16E6和HPV16E7蛋白在宮頸癌組織中呈高表達，且和病理特征有著良好相關性，其表達可能具有預測宮頸癌進展價值，可作為判斷宮頸癌的可靠分子生物學指標。