索拉菲尼聯合TRAIL對誘導人肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響

王德華,劉云燕,李敏然,苗同國,孫杏麗,任桂芳

原發性肝癌是我國常見的惡性腫瘤之一，惡性程度高，易發生侵襲轉移，預后差。近年來，隨著手術、介入治療、射頻消融治療等多手段的綜合應用，肝癌的治療得到進展；但由于該病起病隱匿，發展迅速，部分患者發現時已經失去了綜合治療的機會；因此，分子靶向藥物成為晚期肝癌的主要治療方法之一。索拉菲尼(SOR) 是一種多激酶抑制劑，一方面通過作用于Raf激酶直接抑制腫瘤細胞增殖，一方面通過作用于血管內皮生長因子受體、血小板源生長因子受體-β等抑制腫瘤新生血管生成，一定程度上抑制肝癌細胞生長[1-2]。肝癌的病程進展由多種細胞因子參與，而腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體(TRAIL)就是其中之一。TRAIL屬于腫瘤壞死因子(TNF)超家族，能誘導多種腫瘤細胞凋亡，但對機體正常細胞無毒性，故TRAIL被認為是TNF超家族最有潛能的抗腫瘤細胞因子。由于內源性或獲得性的TRAIL抵抗，使一些癌細胞對TRAIL誘導的凋亡發生了耐受。文獻報道，TRAIL聯合順鉑、阿霉素等化療藥物可增加肝癌細胞對TRAIL的敏感性[3-5]。但目前關于SOR聯合TRAIL作用于肝癌細胞的相關研究較少，故本文將觀察兩者聯合誘導肝癌細胞凋亡的情況。

1 材料與方法

1.1細胞株 肝癌細胞株SMMC-7721，購于中國科學院上海細胞生物學研究院，表型為低分化人肝癌細胞。

1.2主要試劑 SOR[N-(3-三氟甲基-4-氯苯基)-N-(4-(2-甲基氨基甲酰嘧啶)苯氧基)尿素](美國拜耳公司)；四甲基偶氮唑藍(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(Sigma公司)；TUNEL凋亡試劑盒(北京中山生物技術公司)；兔抗人Mcl-1多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；HRP標記山羊抗兔IgG(北京中山生物技術公司)；兔抗β-Actin多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)；硝酸纖維素膜(華美生物工程公司)。

1.3細胞培養 將肝癌細胞株SMMC-7721細胞放于含10%的新生小牛血清、100 U/ml青霉素、100 μg/ml鏈霉素、4 mmol/L谷氨酰胺及1 mmol/ml的HEPES(N-2-羥乙基哌嗪-N-2-乙磺酸)混合成的RPMI-1640培養液中，置于37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中培養。當細胞呈單層致密狀時，用0.04%的ETDA消化后以1∶3傳代，24 h換液，每3 d傳1次代，取對數生長期細胞用于實驗。

1.4比色法檢測細胞生長抑制率 取對數生長期細胞用0.25%胰蛋白酶消化后制備細胞懸液，以1×104個/孔，接種細胞到96孔細胞培養板。培養24 h細胞貼壁后分為3組，SOR組予不同濃度的SOR(0、1、2、4、8 μmol/L)進行干預，TRAIL組予不同濃度的TRAIL(0、10、100、500、1000 ng/ml)進行干預，聯合組予SOR和TRAIL聯合干預(劑量同前)。每組濃度均設4個重復孔。繼續培養24 h，每孔加入5 mg/ml的MTT，37℃、5%CO2及飽和濕度培養箱中孵育4 h，小心吸棄上清液，每孔加入150 μl的DMSO，震蕩10 min后在酶聯免疫檢測儀上選擇570 nm波長測定各孔的吸光度值(A)。以未加藥的細胞株為對照組，計算各組細胞生長抑制率。生長抑制率(%)=(1-實驗組A值/對照組A值)×100%。

1.5流式細胞儀測定細胞凋亡率 將對照組(無血清培養基)、SOR干預組(2 μmol/L)、TRAIL干預組(100 ng/ml)及SOR聯合TRAIL組(2 μmol/L+100 ng/ml)分別作用肝癌細胞株SMMC-7721細胞24 h后，收集細胞，PBS清洗2次，離心，70%乙醇4℃固定，溴化己啶染色30 min，用流式細胞儀作凋亡分析。

1.6Western Blotting 分析 SDS-PAGE灌膠后加入電泳工作液中，上樣后電泳。電泳結束后轉膜。取出硝酸纖維素膜，在封閉液中4℃封閉過夜。封閉結束后，TPBS搖晃洗膜3次，以封閉液稀釋兔抗人Mcl-1多克隆抗體、兔抗β-Actin多克隆抗體，封膜機封口，4℃過夜。再次取出硝酸纖維素膜，TPBS振搖洗膜3次，以封閉液稀釋辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔IgG。按每平方厘米膜加入0.1 ml第二抗體溶液，封口，室溫搖動孵育2 h。最后進行發光反應，X線膠片進一步顯影、定影即可見成像條帶。采用美國Kodak公司ID數碼成像分析系統軟件對Western blot結果進行定量分析，灰度值以積分光密度值(IOD)表示。

2 結果

2.1SOR和TRAIL對肝癌細胞SMMC-7721增殖的影響 MTT法結果顯示，不同濃度SOR單獨處理肝癌SMMC-7721細胞24 h后，細胞生長抑制率隨著濃度的增加而逐漸增強，細胞抑制率均高于對照組(P<0.05)。不同濃度TRAIL單獨處理肝癌細胞SMMC-7721 24 h后，其細胞生長抑制率呈現劑量依賴性，各組之間細胞生長抑制率差異有顯著統計學意義(P<0.05)。當SOR濃度為1 μmol/L時，細胞抑制率<10%，選擇1 μmol/L的SOR聯合不同濃度TRAIL處理肝癌SMMC-7721細胞24 h后，其抑制率均高于相同濃度TRAIL單藥處理組(P<0.05)。見表1。

注：SOR為索拉菲尼，TRAIL為腫瘤壞死因子相關凋亡配體

2.2SOR和TRAIL對肝癌細胞SMMC-7721凋亡的影響 對照組、SOR干預組(2 μmol/L)、TRAIL干預組(100 ng/ml)及SOR聯合TRAIL組(2 μmol/L+100 ng/ml)處理SMMC-7721細胞24 h，SMMC-7721細胞的凋亡率分別為(2.01±0.58)%、(22.58±5.03)%、(19.87±2.05)%與(45.86±3.01)%。3組藥物干預組細胞凋亡率均顯著高于對照組(P<0.1)，SOR干預組的細胞凋亡率與TRAIL干預組比較差異無統計學意義(P>0.05)。而聯合組的細胞凋亡率顯著高于其他2組(P<0.05)。

2.3SOR和TRAIL對肝癌細胞SMMC-7721內Mcl-l蛋白表達的影響 Western blotting測定結果顯示，在40kD的位置出現一條雜交帶，43 kD處出現內參照β-actin的特異條帶。TRAIL干預組(100 ng/ml)、SOR干預組(2 μmol/L)及SOR聯合TRAIL組(2 μmol/L+100 ng/ml)處理細胞12 h后，聯合組Mcl-1表達水平顯著低于對照組。見圖1。

3 討論

近年來，誘導腫瘤細胞凋亡是抗癌治療的熱門研究課題。TRAIL是1995年Wiley等[6]發現的TNF超家族中一個誘導凋亡的分子，它屬于Ⅱ型跨膜蛋白，廣泛表達于多種正常細胞，通過與不同的受體結合而發揮不同的生物學作用。Fabregat等[7]檢測人肝癌組織中TRAIL及其受體的表達，發現TRAIL在癌旁組織中的表達量最高，癌組織中次之，正常肝組織中無表達，其受體DR4、DR5的表達量在肝癌組織中顯著高于正常肝組織。這表明TRAIL是通過其受體DR4和DR5發揮抗肝癌作用。DR4和DR5具有與TNF受體超家族其他成員類似的胞質死亡區，可與TRAIL特異性結合后，通過胞質中的死亡結構域激發和傳導凋亡信號，激活caspasesa參與的酶聯反應誘導細胞凋亡。DcR1無胞內區，DcR2胞內區不完整，因此，雖然DcR1和DcR2可以與DR4、DR5競爭性結合TRAIL，不能傳導凋亡信號，反而抑制細胞凋亡[8]。

圖1索拉菲尼對SMMC-7721細胞內Mcl-l蛋白表達的影響

A為對照組，B為TRAIL干預組、C為索拉菲尼干預組、D為索拉菲尼聯合TRAIL組

TRAIL可誘導多種癌細胞凋亡，同時對正常組織沒有明顯的毒副反應[9]。本研究顯示，不同濃度TRAIL處理肝癌SMMC-7721細胞后，其細胞生長抑制率隨濃度的升高而增加，且一定濃度的TRAIL也可誘導細胞凋亡。目前有部分癌癥對TRAIL產生耐藥性，其耐藥機制包括細胞膜表面TRAIL受體的改變、某些miRNA的表達、Caspase氧化還原等原因[10-12]。因此，需尋找能特異性增強TRAIL誘導細胞凋亡作用的藥物。

SOR是目前世界上第一個被批準應用于臨床的分子靶抗癌向藥物，多項臨床試驗已證實SOR可延長肝癌患者的生存期及改善其預后[13-15]；其作用機制之一在于靶向作用于腫瘤細胞及腫瘤血管上的Ras/Raf/MEK/ERK信號轉導通路，直接抑制腫瘤細胞生長；并且SOR可以阻斷腫瘤新生血管形成，同時起到抗腫瘤細胞和血管生長的雙重作用。文獻報道，SOR能抑制HepG2細胞株的Raf激酶活性，從而阻斷MEK/ERK信號轉導途徑，可降低細胞內cyclinD1水平，抑制癌細胞增殖[16]。本研究結果發現，不同濃度SOR處理肝癌SMMC-7721細胞后，細胞生長抑制率會隨著濃度的增加而逐漸增強，選擇一定濃度SOR聯合TRAIL處理細胞后，其抑制率均高于TRAIL單藥處理組。

SOR能抑制Raf/MEK/ERK信號傳導通路，降低elF4E磷酸化水平下調Mcl-1表達，從而誘導肝癌細胞株凋亡。Mcl-1是Bcl-2凋亡控制蛋白家族中的抗凋亡成員之一，可通過與Bcl-2蛋白家族中促凋亡成員如Bim、Bak等結合，組織線粒體釋放細胞色素C。另外，Mcl-l也可通過與截短的Bid結合阻斷內源性和外源性凋亡信號的交叉聯系。因此，諸多研究提示Mcl-l的表達在內源性和外源性凋亡信號通路中均起到重要作用[17]miR-26b可以負調控Mcl-1的表達，可增敏TRAIL誘導的肝癌細胞的凋亡，故miR-26b-Mcl-1可為肝癌治療的新通路[18]。而SOR與Apo2L/TRAIL受體激動劑抗體結合可增敏Apo2L/TRAIL抵抗細胞，亦增加Apo2L/TRAIL敏感細胞的致敏性，而Jak2-Stat3-Mcl1通路是SOR介導致敏化Apo2L/TRAIL的關鍵[19]。本研究結果顯示聯合組Mcl-1表達水平最低。

SOR或TRAIL于體外呈劑量依賴式抑制肝癌細胞的增殖，適量濃度的SOR聯合TRAIL可增強肝癌細胞的凋亡，其機制有可能通過Mcl-1這一結點發揮了協同作用。因此，本研究結果提示SOR聯合TRAIL可能為肝癌的治療提供新的治療方法，其具體機制有待進一步研究。