粒細胞集落刺激因子在結直腸癌患者血清中的表達及臨床意義

梁鵬鋒，岳樹強，李 霄

結直腸癌(Colorectal cancer, CRC)是世界范圍內發病較高的惡性腫瘤，其發病率和病死率在男性中僅次于前列腺癌和肺癌，在女性中僅次于乳腺癌和肺癌[1]。近期資料顯示，我國結直腸癌發病率高達376.3/10萬人，病死率為191.7/10萬人，且預計未來10年將呈持續上升趨勢[2-3]。目前CRC的主要治療手段仍是以手術切除為主，但因缺少敏感的診斷指標及方法，其早期診斷率較低。約25%的CRC患者在確診時已發生淋巴結或遠處轉移，手術切除率及遠期生存情況均不理想。癌胚抗原(CEA)是目前CRC中檢出率最高的血清標志物，但其臨床陽性率僅為50%左右，具有一定的局限性[4-6]。尋找敏感性和特異性更強的標志物，聯合CEA檢測以提高CRC的臨床早期診斷率并對預后進行準確判斷，是目前研究的熱點與難點問題[7- 8]。粒細胞集落刺激因子(G-CSF)是生理狀態下參與骨髓造血的重要生長因子之一，其主要生理功能是促進骨髓前體細胞形成粒細胞集落，并誘導粒細胞的增殖、分化和遷移。但近期越來越多的研究顯示，G-CSF與肺癌、卵巢癌、乳腺癌、膀胱癌、腦膠質瘤等多種實體腫瘤的發生、惡性進展有密切關系[9-13]。在食管癌、胃癌、膽囊癌、胰腺癌等消化系統腫瘤組織中，G-CSF的表達也顯著高于正常對照組織，且表達強度與患者的生存時間呈負相關[14-17]。但G-CSF在CRC患者外周血中表達情況及其檢測的臨床價值、意義卻報道不多。本研究收集了107例CRC患者的術前外周血并以結直腸腺瘤(Colorectal adenoma,CRA)患者及健康人群的外周血為對照組，檢測并對比血清中G-CSF含量的差異，以期為CRC的臨床早期診斷提供依據。現報告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料 選取于2009年1月—2014年10月在陜西省渭南市中心醫院普通外科和西京醫院肝膽外科確診并接受外科手術治療的CRC 107例為CRC組。男66例,女41例；平均年齡(55.8±17.6)歲。腫瘤位于結腸58例，直腸49例。患者術前均未施行化療或其他治療，術后經病理學檢查證實手術切緣為陰性。病理分級：高分化44例，中分化38例，低分化25例。根據2016年國際抗癌聯盟(UICC)發布的第八版結直腸癌TNM分期標準：I期29例，II期26例，III期47例，IV期5例。選取同期行外科手術治療的75例CRA為CRA組：男48例，女27例；平均年齡(53.2±22.5)歲。同期行健康查體人群120例為健康體檢組：男68例，女52例；平均年齡(49.9±19.3)歲。3組性別、年齡比較差異無統計學意義(P>0.05)，具有可比性。3組均簽署同知情意書。本研究經醫院倫理委員會批準。

1.2外周血標本收集與處理 CRC組和CRA組于手術前1天，健康體檢組于查體當天，抽取清晨空腹外周靜脈血4 ml，注入促凝管中室溫放置30 min，待其完全凝固并析出淡黃色血清后以4000轉/min 離心10 min，抽取上層血清，放入-80℃低溫冰箱中保存備用。

1.3病例隨訪情況 對于CRC組進行術后隨訪，以手術當天為隨訪開始時間，采用電話隨訪或門診復查的方式進行，隨訪終點為死亡日或至最后一次隨訪時間，隨訪截止日期為2017-09-12。至隨訪結束，共失訪病例11例，其中男5例，女6例。最終96例CRC患者完成術后隨訪及生存觀察，隨訪周期為3～73(43.9±21.1)個月，中位隨訪時間為47.5個月，隨訪過程中，如果懷疑患者腫瘤復發，立即行結腸鏡檢查確診。

1.4血清G-CSF含量測定 采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組血清G-CSF含量(試劑盒購自美國RD公司)，操作方法參照試劑盒說明書：將不同濃度的標準品和3組待測血清樣本加入微孔反應板中，100 μl/孔；各孔加入生物素化抗體工作液50 μl，振蕩混勻后室溫放置120 min；反應結束后，將各孔內液體吸干并反復洗滌5次；洗滌干燥后再加入酶結合物工作液100 μl/孔；振蕩混勻后室溫放置30 min；反應結束后，將各孔內液體吸干并反復洗滌5次；各孔再加入顯色劑A、B各50 μl，振蕩混勻，37℃下避光反應顯色10 min；顯色結束后，加入終止液50 μl，振蕩混勻。最后，在490 nm的條件下以酶標儀檢測標準品各孔的吸光度，繪制標準曲線后計算得到各組待測血清樣本內的G-CSF含量。

2 結果

2.13組樣本血清G-CSF 的含量 CRC組、CRA組、健康體檢組的血清G-CSF含量分別為(205±32.3)、(84±12.6)、(16±5.1)pg/ml。CRC組和CRA組的血清G-CSF含量顯著高于健康體檢組(t=63.24、52.76，P<0.001)。CRC組血清G-CSF含量顯著高于CRA組(t=30.69，P<0.001)。

2.2血清G-CSF的Cut-off值及診斷價值 血清G-CSF 數值繪制的ROC曲線下面積(AUC)為0.656，95%CI為(0.584-0.729)。最大約登指數為0.392，此時靈敏度為0.469、特異度為0.923，G-CSF的Cut-off值為27.75 ng/ml。CEA的AUC為0.728，95%CI為(0.661-0.795)，最大約登指數為0.450，此時靈敏度為0.491、特異度為0.959。見圖1。G-CSF與CEA的AUC數值比較差異無統計學意義(Z=1.279,P=0.095)。而將G-CSF和CEA的數值進行聯合分析時，其靈敏度為0.592、特異度為0.973，最大約登指數為0.565。

根據ROC曲線分析確定G-CSF的Cut-off值為27.75 ng/ml，CEA的Cut-off 值采用臨床正常參考值，即5 ng/ml；若檢測值超過Cut-off 值則記為陽性結果。據此，將96例CRC患者分為以下4組：A組G-CSF(+)/ CEA (+)，27例；B組G-CSF(+)/CEA(-)，18例；C組 G-CSF(-)/CEA(+)，23例；D組G-CSF(-)/CEA (-)，28例。A-D組患者的中位生存時間依次為27、49、50、65個月；生存時間依次為(34.3±19.7)、(43.7±20.8)、(45.9±20.0)、(51.8±19.6)個月。對4組生存情況進行log-rank檢驗分析，結果表明G-CSF(-) /CEA(-) 組生存時間最長，G-CSF(+)/CEA (+) 組生存時間最短(χ2=11.505,P=0.009)。見圖3。

圖13組血清樣本中CEA和G-CSF含量的ROC曲線

注：CEA為癌胚抗原，G-CSF為粒細胞集落刺激因子

2.3CRC患者血清G-CSF含量與臨床病理特征的關系 以27.75 ng/ml為Cut-off 值，將96例CRC患者分為G-CSF高表達組45例和低表達組51例，在腫瘤直徑、分化程度、淋巴結轉移和TNM分期等指標中，2組比較差異有統計學意義(P<0.001)。見表1。

2.4CRC患者血清G-CSF含量與生存情況的關系 高表達組生存時間為(38.0±20.7)個月，中位生存時間35個月；3 年及5年生存率分別為48.9%及26.7%。低表達組生存時間為(49.1±20.0)個月，中位生存時間58 個月；3年及5年生存率分別為68.6%及47.1%。G-CSF高表達組生存情況差于低表達組(χ2= 7.335,P=0.007)。見圖2。

表1 結直腸癌患者血清粒細胞集落刺激因子含量與臨床病理特征的關系

注：*為應用Fisher精準概率法

圖2CRC患者血清中G-CSF含量與生存情況的關系

注：CRC為結直腸癌，G-CSF為粒細胞集落刺激因子

圖3血清G-CSF聯合CEA分析結直腸癌患者生存情況

注：CEA為癌胚抗原，G-CSF為粒細胞集落刺激因子

3 討論

CRC的起病較為隱匿，早期基本無特異性臨床表現和癥狀，一旦出現明顯癥狀來醫院就診時，大多數患者又處于疾病進展期或晚期，手術切除率較低。早期診斷是提高CRC療效的關鍵，但結直腸鏡開展條件要求較高，而影像學檢查的特異性又差，尋找敏感而高效的分子診斷標志物或聯合診斷方案，是目前的研究熱點與難點。

G-CSF屬于I類細胞因子受體超家族成員，其結構為單次跨膜蛋白，包含免疫球蛋白樣結構域和細胞因子受體同源結構域；生理情況下與粒細胞集落刺激因子受體(G-CSFR)結合后促進多種造血細胞及非造血組織細胞的增殖、分化及遷移。但目前研究表明，在腫瘤環境中，G-CSF與G-CSFR結合后可激活多個細胞內信號通路，促進腫瘤生長、侵襲和轉移。Morris等[18]在人胃癌細胞系的培養基質中添加不同濃度的G-CSF重組蛋白，發現胃癌細胞的增殖活性顯著升高，且表現出劑量依賴性；進一步在結腸癌細胞系中也重復出相似的結果，且G-CSF的促細胞增殖效果較胃癌更為明顯。在反向驗證實驗中，當利用G-CSF抗體中和G-CSF后，細胞增殖能力顯著降低。與此相似的實驗，在腦膠質瘤細胞、乳腺癌細胞、膀胱癌細胞、卵巢癌細胞中也得到同樣的結果[19- 20]。G-CSF可能在腫瘤發生、發展中發揮類似促癌基因的功能，與多種腫瘤特別是消化系統腫瘤存在密切聯系，但其在CRC 患者血清中的表達規律及其臨床意義尚無相關研究報道。

本研究檢測發現，CRC患者血清中G-CSF含量顯著升高，其診斷靈敏度、特異度與CEA比較無差異，但兩者聯合應用時的靈敏度和特異度均有明顯提升，優于單個指標的檢測。本研究結果顯示：在CRC的早期診斷與篩查中，G-CSF與CEA的聯合檢測方案可能具有較好的應用價值。進一步的臨床病理指標分析發現，G-CSF高表達組的患者群體腫瘤體積、分化程度和TNM分期等指標均出現明顯進展或惡化。而進一步的生存分析也表明，G-CSF高表達組的3年和5年總體生存率顯著低于低表達組。本研究利用ROC曲線分析確定CRC患者體內G-CSF含量的Cut-off 值，并聯合CEA對其生存情況進行分析，結果顯示，外周血呈雙陰性表達的CRC患者群體生存情況最好，而雙陽性表達的CRC患者群體生存情況最差，表明這兩個標志物的組合有助于判斷CRC患者的預后情況。

綜上所述，本研究初步明確CRC患者外周血中G-CSF的含量升高，提示腫瘤出現惡性進展，且與癌細胞的增殖存在較密切的相關性。G-CSF可能是CRC早期診斷的潛在腫瘤標志物，與CEA聯合檢測時可提高對CRC的診斷靈敏度和特異度，是一個具有良好潛在應用前景的分子標志物。