60Co-γ輻射對‘龍牧806’苜蓿幼苗生長和葉片生理和細(xì)胞結(jié)構(gòu)的影響

李 ， ，

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護(hù)黑龍江省重點實驗室，黑龍江省 齊齊哈爾市161006)

苜蓿是世界上最重要、最有價值的栽培牧草之一，在全世界范圍內(nèi)廣泛種植，對環(huán)境適應(yīng)能力強，產(chǎn)量高，品質(zhì)好，營養(yǎng)價值高，富含蛋白質(zhì)、礦物質(zhì)、維生素、氨基酸和微量元素等重要營養(yǎng)成分，可作為良好的精飼料替代品[1-2]。苜蓿的根系發(fā)達(dá)，能吸收到土壤深層的水分和養(yǎng)分，還可減少水土的流失，起到保持水土的作用[3]，對農(nóng)牧業(yè)結(jié)構(gòu)調(diào)整起到推動作用。

通過誘變育種能夠獲得有用的突變材料和變異植株[4]，誘變育種的方法有空間誘變、零磁空間誘變和輻射誘變等[5]，其中60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，目前國內(nèi)外關(guān)于牧草的γ射線輻射誘變育種工作廣泛展開, 主要集中在牧草品種對射線的輻射敏感性及育種的適宜劑量[6-7]、生理生化的影響等[8-9]。植物體的形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理功能是統(tǒng)一的，功能的差異必然與相應(yīng)的器官結(jié)構(gòu)緊密相關(guān)，但利用60Co-γ射線輻射研究其對植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)的變化研究甚少。本文對輻射后龍牧806苜蓿幼苗生長、生理和葉片結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究和分析，以期了解其幼苗生長生理和顯微結(jié)構(gòu)對輻射的響應(yīng)，從而更好的了解性狀突變的變化規(guī)律，為利用60Co-γ射線輻射選育苜蓿新品種提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

以黑龍江省畜牧研究所提供的‘龍牧806’苜蓿(MedicagosativaL.×Meliloidesruthenica(L.) Sojak. ‘Longmu 806’)干種子(2015年收獲，種子儲藏在低溫種子庫)為材料，其具有耐寒性、耐鹽堿，高產(chǎn)等特性，適合在低溫及鹽堿地上栽種。

1.2 方法

1.2.160Co-γ射線輻射處理60Co-γ輻射源由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600，900，1 200和1 500 Gy 4個劑量，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數(shù)量未經(jīng)處理的種子作為對照(CK)。

1.2.2幼苗的培養(yǎng) 取4種劑量的60Co-γ(600，900，1 200和1 500)射線輻射處理和未輻射的龍牧806苜蓿種子，采用土培的方法將其種植在直徑為30 cm花盆(針葉土、營養(yǎng)土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進(jìn)行混合)，每盆中均勻撒上30粒種子，每個劑量種植10盆，待幼苗生長至三葉一心期后備用。

1.2.3幼苗生長指標(biāo)測定 選取培養(yǎng)一個月左右的龍牧806苜蓿幼苗，各輻射組和對照組中隨機選取10株具代表性的幼苗，利用刻度尺分別測量株高(cm)和主根長度(cm)，精確到0.01并計算其平均值。將幼苗的地上和地下分開，在60℃烘箱中烘干，測定地上和地下干重即為地上和地下生物量,并計算其根冠比。

根冠比= 植株的地下生物量/地上生物量

1.2.4生理指標(biāo)測定 隨機選取各輻射劑量龍牧806苜蓿幼苗葉片并測定各生理指標(biāo)，其中可溶性蛋白含量采用考馬斯亮藍(lán)法，可溶性糖含量和丙二醛的測定采用硫代巴比妥酸法，脯氨酸含量采用酸性茚三酮法，相對電導(dǎo)率采用電導(dǎo)法[8]。各測定值均重復(fù)3次。

1.2.5透射電鏡切片制作及樣品觀察 選取對照組和輻射組相同葉位的葉片，取其中部約2 mm×4 mm樣品,立即投入含2.5% 戊二醛固定液中2 h, 用0.1 mol·L-1磷酸沖30 min，再經(jīng)1% 鋨酸緩沖液固定2 h, 蒸餾水對樣品進(jìn)行沖洗30 min, 系列濃度的乙醇脫水(各15 min)，環(huán)氧樹脂包埋，切成1 μm左右厚度的半薄切片，再經(jīng)醋酸雙氧鈾50%酒精飽和溶液染色30 min，日立H-7650型透射電子顯微鏡觀察和攝影，電壓100 kV。

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用Excel 2010對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，采用SPSS 17.0中單因素方差分析(one-way ANOVA)對植物生理特征指標(biāo)進(jìn)行差異顯著性檢驗。

采用隸屬函數(shù)法[9]，綜合評價不同輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿葉片生理的影響。

隸屬函數(shù)值計算公式：R(Xi)=(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)，反隸屬函數(shù)值計算公式：R(Xi) =1-(Xi-Xmin) /(Xmax-Xmin)(式中，Xi為指標(biāo)測定值，Xmin、Xmax為所有實驗材料某項指標(biāo)的最小值和最大值)。將隸屬值進(jìn)行累加求出平均數(shù)，如公式：X= ΣU(Xi)/n，X是所求平均隸屬值。

2 結(jié)果與分析

2.1 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗生長影響

60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗和地上長度及主根長度的變化見表1，隨著輻射劑量的增加，各輻射處理組的株高均呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢，主根長度出現(xiàn)降低的變化趨勢。幼苗的主根長度表現(xiàn)為隨著輻射劑量的增加而抑制作用增加，在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，幼苗的主根平均長度分別比對照降低了21.93%，38.26%，60.19%和65.79%；600和900 Gy低劑量輻射促進(jìn)龍牧806苜蓿幼苗的地上生長，分別比對照增加了25.13%和15.41%，1 200和1 500 Gy輻射劑量下抑制幼苗的地上生長。幼苗的生長對輻射反應(yīng)比較敏感，主要通過幼苗的株高和主根長度的變化反應(yīng)出來，不同劑量的60Co-γ射線輻射對幼苗生長的影響，表現(xiàn)為低劑量輻射促進(jìn)了地上部分的幼苗生長，高輻射劑量抑制了其地上和地下部分的生長。

各輻射處理組幼苗地上和地下生物量隨輻射劑量的增加而減少(見表1)，根冠比出現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，幼苗地上生物量分別比對照降低了21.74%，42.57%、68.57%和70.90，幼苗地下生物量分別比對照降低了13.45%，14.74%，58.87%和65.15%，根冠比分別比對照增加了10.56%，46.67%，30.82%和19.70%。輻射對龍牧806苜蓿幼苗地上生物量積累和根冠比產(chǎn)生了顯著的影響(P<0.05)，高輻射劑量對其地下生物量積累產(chǎn)生了顯著的影響(P<0.05)。

表1 60Co-γ輻射龍牧806苜蓿種子的幼苗生長指標(biāo)的變化Table 1 The change of seedlings growth indexes of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.) Sojak.‘Longmu 806’ seeds under 60Co-γ radiation

注: 同列不同小寫字母表示顯著差異(P<0.05)，下同

Note: Different lowercase letters in the same column indicate significant difference at the 0.05 level, the same as below

2.2 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗葉片生理的影響

在不同劑量60Co-γ輻射下的‘龍牧806’苜蓿葉片可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量變化見表2，60Co-γ輻照后的可溶性蛋白、脯氨酸和可溶性糖含量呈現(xiàn)先增加后降低的變化趨勢。輻射劑量為600 Gy時，‘龍牧806’苜蓿葉片脯氨酸和可溶性蛋白含量最高，1 200 Gy輻射劑量最低。600和900 Gy輻射劑量與對照組比其可溶性蛋白的含量分別增加了63.44%和31.16%，輻射劑量為1 200和1 500 Gy時，可溶性蛋白含量分別比對照降低了35.60%和75.31%。60Co-γ輻射的‘龍牧806’苜蓿葉片脯氨酸和可溶性糖含量均高于對照組，在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，與對照組比脯氨酸含量分別增加了75.24%，38.09%，25.60%和12.19%，可溶性糖含量分別增加了82.41%，266.42%，236.07%和186.90%。60Co-γ輻射對可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的積累產(chǎn)生顯著影響(P<0.05)。

60Co-γ輻照后的丙二醛含量和相對電導(dǎo)率呈現(xiàn)增加的變化趨勢(見表2)，在600，900，1 200和1 500 Gy輻射劑量下，與對照組比丙二醛含量分別增加了93.63%，609.77%，695.70和714.93%，相對電導(dǎo)率與對照組比較分別增加了20.58%，93.95%，111.64%和129.98%。輻射處理丙二醛含量和相對電導(dǎo)率與對照比較差異顯著(P<0.05)，特別是在輻射劑量為1 200和1 500 Gy下，丙二醛含量和相對電導(dǎo)率增加幅度最大，說明此輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿葉片細(xì)胞質(zhì)膜損傷加大，導(dǎo)致質(zhì)膜透性加大。

2.3 隸屬函數(shù)分析

輻射對‘龍牧806’苜蓿幼苗的形態(tài)和生理變化產(chǎn)生不同的影響，同時各指標(biāo)中存在著一定的相關(guān)性和差異性，在具體進(jìn)行輻射評價時需要綜合考慮。將各個處理下測定‘龍牧806’苜蓿幼苗的形態(tài)和生理各指標(biāo)的數(shù)據(jù)代入隸屬函數(shù)公式中計算出隸屬值，5項形態(tài)指標(biāo)和5項生理指標(biāo)的隸屬值見表3，隸屬函數(shù)綜合評價值越大，表明輻射對‘龍牧806’苜蓿幼苗形態(tài)和葉片的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累越多和膜脂透性的影響越小，根據(jù)隸屬函數(shù)平均值的大小，不同輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿幼苗形態(tài)和葉片生理指標(biāo)影響的綜合排序依次為600 Gy>900 Gy>0 Gy>1 200 Gy>1 500 Gy，600～900 Gy輻射劑量可以應(yīng)用于苜蓿的輻射誘變育種。

表2 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗葉片五項生理指標(biāo)變化Table 2 The five physiological indexes changes of seedling leaves of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.) Sojak.‘Longmu 806’ seeds under 60Co-γ radiation

表3 ‘龍牧806’苜蓿幼苗形態(tài)和葉片生理指標(biāo)隸屬值Table 3 The membership values of morphology and leaf physiology of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.)Sojak. ‘Longmu 806’ seedlings

2.4 60Co-γ輻射‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗葉片超微結(jié)構(gòu)差異性分析

植物在經(jīng)過逆境環(huán)境條件下，葉片內(nèi)部細(xì)胞結(jié)構(gòu)、葉綠體和線粒體的形態(tài)結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯的變化[10-12]。由圖1可以看出，不同劑量的60Co-γ射線處理‘龍牧806’苜蓿種子的幼苗，其葉片細(xì)胞和葉綠體結(jié)構(gòu)產(chǎn)生不同程度的影響。未輻射的‘龍牧806’苜蓿葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，形狀規(guī)則，多呈橢圓形，細(xì)胞壁平整，厚度均勻，葉綠體結(jié)構(gòu)規(guī)則，膜輪廓完整，葉綠體緊貼細(xì)胞膜排列，基粒和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)完整，無淀粉粒出現(xiàn)，線粒體結(jié)構(gòu)完整，可見明顯嵴的結(jié)構(gòu)(見圖1的A～D)；低劑量600和900 Gy的‘龍牧806’苜蓿葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變化，細(xì)胞形態(tài)較規(guī)則，葉綠體數(shù)量減少，松散排列在細(xì)胞中(見圖1的E～H、I～L)，線粒體結(jié)構(gòu)完整，可見嵴的結(jié)構(gòu)，輻射劑量為900 Gy時，細(xì)胞出現(xiàn)輕微質(zhì)壁分離現(xiàn)象，(見圖1的I～L)。高劑量1 200和1 500 Gy的‘龍牧806’苜蓿葉片，細(xì)胞及細(xì)胞內(nèi)的結(jié)構(gòu)較對照組和低劑量輻射組產(chǎn)生明顯的變化，細(xì)胞形狀不規(guī)則，細(xì)胞膨脹變大，壁較平整，厚度較均勻，出現(xiàn)嚴(yán)重的質(zhì)壁分離現(xiàn)象，葉綠體數(shù)量減少，排列松散，片層結(jié)構(gòu)比較完整，排列不規(guī)則，出現(xiàn)了大量個體大的淀粉粒，線粒體數(shù)目減少，嵴不明顯，(見圖1的M～P、Q～T)。不同劑量的60Co-γ射線處理‘龍牧806’苜蓿的幼苗，其葉片細(xì)胞、葉綠體、線粒體和淀粉粒等形態(tài)和數(shù)量產(chǎn)生了不同的變化，隨著輻射劑量的加大，葉片細(xì)胞和葉綠體形態(tài)出現(xiàn)明顯變形，類囊體片層嚴(yán)重扭轉(zhuǎn)，葉綠體被大量淀粉粒占據(jù)，線粒體數(shù)量明顯減少。

圖1 不同輻射條件下‘龍牧806’苜蓿葉片細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)Fig. 1 The morphological structure of Medicago sativa L.×Meliloides ruthenica (L.) Sojak. ‘Longmu 806’leaves cells under different radiation注：圖A～D、E～H、I～L、M～P、Q～T分別為輻射劑量為0，600，900，1 200，1 500 Gy葉片細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)。CW.細(xì)胞壁；Chl.葉綠體；MM.線粒體膜；G.基粒；GL.基粒片層；SL.基質(zhì)片層；OG.嗜鋨顆粒；SG.淀粉粒；CM.葉綠體膜；Cr.嵴Note: A～D, E～H, I～ L, M～P and Q～T were cell morphologic structure of leaf under radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500Gy, respectively. CW.Cell wall; Chl.Chloroplast; MM.Mitochondria membrane; G.Granulation; GL.Granulation lamella; SL.substrate lamellae; OG.Osmium granule; SG.Starch granules; CM. Chloroplast membrane; Cr. Cristae

3 討論

植物在生長發(fā)育的過程中經(jīng)常會遇到干旱、極端溫度、土壤鹽化、養(yǎng)分匱乏、重金屬脅迫等不良環(huán)境條件，植物會逐漸演化出各種各樣形態(tài)結(jié)構(gòu)以適應(yīng)逆境[12]。葉片是植物進(jìn)化過程中對環(huán)境變化敏感的器官[13]，因此研究幼苗生長生理和葉片的結(jié)構(gòu)特征可以反映出植物對逆境的適應(yīng)能力。

幼苗的生長狀況是表現(xiàn)輻射生物學(xué)效應(yīng)的一項重要參考指標(biāo)[14]，低于900 Gy的輻射劑量對‘龍牧806’苜蓿苗高度影響有一定的促進(jìn)作用，高于1 200 Gy 的輻射對幼苗生長抑制作用顯著，高輻射劑量導(dǎo)致成苗期間幼苗矮化和根系短粗等明顯的變化。植株的生物量直接反映植株的生長狀況和植物光合作用產(chǎn)物積累的多少，隨著輻射劑量的增加，地上生物量和地下生物量均呈現(xiàn)下降的趨勢，與李瑜等人[8]研究60Co-γ輻射對桂花幼苗生長的影響結(jié)果一致。雖然60Co-γ射線處理對‘龍牧806’苜蓿地上生物量和地下生物量影響不同，但其都影響了光合同化物的合成[15]，致使降低其生物量的積累，植物地上部分生長則需要靠根部運輸水分，而且植物葉片蒸騰作用散失的水分量大，所以地上部分對水分虧缺產(chǎn)生的反應(yīng)比根系對水分虧缺產(chǎn)生的反應(yīng)更敏感，因此‘龍牧806’苜蓿幼苗的根冠比也發(fā)生了變化。輻射劑量為900 Gy時，根冠比達(dá)到最大，說明適當(dāng)增加輻射劑量可以增加‘龍牧806’苜蓿幼苗根系所占比例，增強根系吸水能力，同時地上生物量的減少降低了水分的散失，使植物能夠長期保持不缺水的狀態(tài)，從而植物能夠更好地生長。

植物體內(nèi)可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸是一種理想的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，逆境條件下通過主動積累這些物質(zhì)對植物起著有效的保護(hù)作用[16]。以誘發(fā)突變?yōu)槟康牡妮椛涮幚恚瑫斐芍参锏纳頁p傷，600～1 500 Gy輻照處理后，‘龍牧806’苜蓿葉片脯氨酸和可溶性糖含量增加，表明該輻射范圍可以對‘龍牧806’苜蓿葉片產(chǎn)生不同程度的修復(fù)作用，但隨輻射劑量的增加，對損傷的修復(fù)能力減弱。600～900 Gy輻射‘龍牧806’苜蓿，可溶性蛋白積累量均高于對照組，這說明低輻射劑量可以促進(jìn)‘龍牧806’苜蓿體內(nèi)可溶性蛋白的積累，提高其對輻射損傷的能力。這與李鳳濤等人[17]研究60Co-γ輻射對白刺花幼苗生理的影響和張玉等人[18]研究60Co-γ輻射對菊苣幼苗生理影響結(jié)果基本一致。

植物在受到逆境脅迫時，膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量和相對電導(dǎo)率的高低與細(xì)胞膜的傷害程度呈正相關(guān)。本研究中，隨著輻射劑量的增加，丙二醛的含量以及相對電導(dǎo)率均表現(xiàn)為上升的變化趨勢，特別是在高劑量輻射下，‘龍牧806’苜蓿葉片丙二醛含量和相對電導(dǎo)率最高，說明在高輻射劑量下對‘龍牧806’苜蓿葉片細(xì)胞膜傷害比較大。李瑜[8]研究60Co-γ輻射對桂花幼苗生長及生理指標(biāo)的影響也得出了相似的結(jié)果。

‘龍牧806’苜蓿幼苗生長、生物量積累、游離脯氨酸、可溶性蛋白和可溶性糖含量等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)和相對電導(dǎo)率、MDA含量均能反映輻射對植物生長、滲透調(diào)節(jié)和細(xì)胞膜受到的傷害程度，同時各指標(biāo)中存在著一定的相關(guān)性和差異性，在具體進(jìn)行評價時需要綜合考慮[18]。輻射處理下幼苗的生長和生理指標(biāo)變化不同，應(yīng)用單一指標(biāo)對其輻射的反應(yīng)不能準(zhǔn)確評價。在4種輻射劑量中，60Co-γ輻射劑量為600～900 Gy范圍內(nèi)對‘龍牧806’苜蓿的生長和生理產(chǎn)生正向影響，而1 200～1 500 Gy對‘龍牧806’苜蓿的生長和生理產(chǎn)生負(fù)向影響。

植物在不同的逆境環(huán)境下，葉片細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)會發(fā)生明顯的變化。試驗通過不同劑量的60Co-γ射線處理后其葉片內(nèi)部的結(jié)構(gòu)進(jìn)行透射電鏡的分析，經(jīng)過高輻射過后‘龍牧806’苜蓿的葉片內(nèi)部的結(jié)構(gòu)出現(xiàn)變形嚴(yán)重，細(xì)胞發(fā)生質(zhì)壁分離的現(xiàn)象，葉片細(xì)胞內(nèi)部葉綠體結(jié)構(gòu)松散、類囊體扭曲，淀粉粒的數(shù)量變大變多。這與張興芬等人[19]研究60Co-γ輻照對三七葉片細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)、葉綠體和線粒體的形態(tài)和結(jié)構(gòu)的變化和王順才等人[20]研究干旱脅迫下3種蘋果屬植物葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響的結(jié)果基本一致。

4 結(jié)論

60Co-γ射線對‘龍牧806’苜蓿種子的輻射效應(yīng)明顯，主要表現(xiàn)為低輻射處理促進(jìn)‘龍牧806’苜蓿幼苗的生長、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累，細(xì)胞膜的傷害程度和細(xì)胞形態(tài)、線粒體和葉綠體等結(jié)構(gòu)影響比較小，而高輻射處理使幼苗生長變緩，株高變矮，可溶性蛋白和脯氨酸含量降低，細(xì)胞膜的傷害程度和細(xì)胞形態(tài)、線粒體和葉綠體結(jié)構(gòu)受到不同程度的改變。綜合分析幼苗生長、生理和細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)，結(jié)果表明 600～900 Gy是‘龍牧806’苜蓿60Co-γ射線誘變育種較為合適的劑量范圍。