60Co-γ射線輻射對苜蓿根莖葉顯微結構的影響

李 ，

(齊齊哈爾大學生命科學與農林學院， 抗性基因工程與寒地生物多樣性保護黑龍江省重點實驗室， 黑龍江 齊齊哈爾161006)

紫花苜蓿(MedicagosativaL.)是最有價值的栽培牧草之一，世界各地廣泛種植，根系發達，主根粗大，抗逆境和可再生能力較為強大，產草量高，富含蛋白質，適口性好，固氮能力強，是我國人工種植面積最大的豆科牧草[1-2]，在我國生態環境建設、生態修復方面起著重要的作用[3]。

60Co-γ射線輻照是最為有效的人工誘變育種方法之一，目前國內外關于牧草的γ射線輻射誘變育種工作廣泛展開, 主要集中對牧草品種對射線的輻照敏感性、育種的適宜劑量及其輻射誘變規律的研究[4-6]。植物體的形態結構和生理功能是統一的，功能的差異必然與相應的器官結構緊密相關[7]。利用60Co-γ射線輻照研究其對植物顯微結構的影響的研究甚少，如李黎等利用60Co-γ輻射對兩個不同品種菊花的葉片組織結構的影響進行研究，通過電鏡觀察發現，輻射后植株葉片的柵欄組織的排列比對照植株排列疏松，柵欄組織細胞層數增多[8]。本文研究了60Co-γ輻射苜蓿根莖葉等營養器官的生理結構的影響，以期為利用60Co-γ射線輻照選育苜蓿新品種提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為黑龍江省畜牧研究所提供的‘龍牧806’苜蓿干種子，其具有耐寒、耐鹽堿，高產等特性，適合在低溫及鹽堿地上栽種。

1.2 研究方法

1.2.160Co-γ射線輻射處理60Co-γ輻射源由中國農業科學研究院原子能利用研究所提供，輻射劑量依次為600，900，1 200，1 500 和1 800 Gy共5個劑量，劑量率15 Gy·min-1，每份處理50 g種子，以同一批次相同數量未經處理的種子作為對照(CK)。

1.2.2幼苗的培養 取5種劑量的60Co-γ(600，900，1 200，1 500和1 800 Gy)射線輻射處理和未輻射的苜蓿種子，采用土培的方法將其種植在營養缽中(針葉土、營養土和珍珠巖按1∶2∶0.5比例進行混合)，1 800 Gy輻射劑量的苜蓿種子雖然能出苗，但在培養期間逐漸死亡，其它輻射劑量和對照的苜蓿幼苗待生長至三葉一心期后備用。

1.2.3顯微結構樣品的制備與觀測 45 d后分別剪取各處理植株根、莖、葉材料，根部為成熟區的相同部位，莖采集第3葉位的莖段，葉片取第3葉位三出復葉中間小葉的中部[7]，葉片中部葉脈為中心橫切成大小為5 mm×7 mm的小塊，根、莖切成1 cm長的小段。立即用福爾馬林-乙酸-乙醇固定液(FAA)固定，1%番紅水溶液染色2 h，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，切片厚度為8～12 μm，用0.5%固綠復染，中性膠封片，于Motic-MODEL-BA300LE顯微鏡下觀察和攝影，每個處理樣本隨機取10個視野求平均值。

1.3 數據分析

柵海比=柵欄組織厚度/海綿組織厚度

葉片柵欄組織結構緊密度(CTR)=(柵欄組織厚度/葉片厚度)×100%

葉片海綿組織結構疏松度(SR)=(海綿組織厚度/葉片厚度)×100%

利用Excel 2010對數據進行整理，采用SPSS 17.0中單因素方差分析(one-way ANOVA)對植物組織結構特征指標進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 60Co-γ射線輻射對苜蓿根顯微結構的影響

苜蓿根的顯微結構包括表皮、皮層、維管柱組成(圖1)。在不同劑量的60Co-γ輻射處理下，苜蓿根的直徑、皮層薄壁細胞的厚度、表皮的厚度、維管柱的直徑、原生導管及后生導管的直徑均會產生不同程度的影響。當輻射劑量為1 500 Gy時，苜蓿根的厚度、皮層薄壁細胞的厚度、表皮的厚度，維管柱的直徑、原生導管及后生導管的直徑均達到最大值。

不同輻射劑量處理下苜蓿根的表皮和皮層厚度、根、導管和維管柱直徑均隨著輻射劑量的增加呈現上升變化趨勢(表1)，當輻射劑量為600和1 500 Gy時，根表皮的厚度比對照組增加了34.32%和111.9%，根皮層厚度比對照組增加了12.27%和39.39%，根直徑比對照組增加了36.05%和209.87%，根原生導管的直徑比對照組增加了14.03%和137.19%，后生導管的直徑比對照組增加了39.29%和129.44%，根維管柱直徑比對照組增加了41.00%和251.29%。低劑量與高劑量之間苜蓿根的表皮厚度、皮層厚度、根直徑、原生導管直徑、后生導管直徑和維管柱直徑均差異顯著(P<0.05)。輻射對根的維管柱直徑和根厚度影響最大，其次為原生導管直徑、后生導管直徑和表皮厚度，對皮層厚度影響最小。

表1 60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗根顯微結構的特征Table 1 Root structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

注：同列不同小寫字母表示差異顯著, 下同

Note: Different small letters in the same row indicate significant difference at the 0.05 level. The same as below

圖1 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗根解剖結構Fig.1 Roots anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：圖中1，2，3，4和5依次為輻射劑量0,600,900,1 200和1 500 Gy時根的顯微結構(×40)；6，7，8，9和10依次為輻射劑量0,600,900,1 200和1 500 Gy時根的顯微結構(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×40), and the 6, 7, 8, 9 and 10 micrographs of the root were in the order of radiation dose of 0, 600, 900, 1 200 and 1 500 Gy (×400)

2.2 60Co-γ射線輻射對苜蓿莖顯微結構的影響

莖的顯微結構由表皮、皮層、維管束和髓組成(圖2)。在不同劑量的60Co-γ射線輻射處理下，苜蓿莖的表皮和皮層薄壁厚度、維管束和髓直徑均會產生不同程度的影響。當輻射劑量達1 500 Gy時，苜蓿莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑均達到最大值。

經過不同輻射劑量處理后，苜蓿莖的表皮和皮層薄壁細胞厚度及維管束直徑和髓直徑均產生不同程度的變化(表2)。當輻射劑量為600和1 500 Gy時，其莖的表皮厚度與對照組比較增加了23.23%和59.01%，皮層薄壁細胞厚度與對照比較增加了1.74%和24.48%，維管束直徑與對照比較增加了9.95%和52.72%，髓的直徑與對照比較增加了20.42%和69.07%。除600和900 Gy輻射劑量外的皮層薄壁細胞厚度外，其它輻射劑量的苜蓿莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑與對照比較均差異顯著(P<0.05)，特別是高輻射劑量對苜蓿莖的顯微結構的影響更大。輻射對莖的表皮厚度、維管束直徑和髓的直徑影響比較大，對皮層薄壁細胞厚度影響最小。

2.3 60Co-γ射線輻射對苜蓿葉片顯微結構的影響

葉的顯微結構由上下表皮、葉肉和葉脈組成(圖3)。在不同劑量的60Co-γ射線輻射處理下，苜蓿葉片的上表皮、下表皮、葉片、柵欄組織、海綿組織脈凸起厚度均會產生不同程度的影響。當輻射劑量達1 500 Gy時，苜蓿葉片的上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均達到最大值。

經不同輻射劑量處理后，苜蓿葉片的上表皮厚度、下表皮厚度、葉片厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均產生不同程度的變化(表3)。當輻射劑量為600和1 500 Gy時，其葉片厚度分別比對照組增加了6.43%和30.86%，上表皮厚度分別比對照組增加了3.95%和47.29%，下表皮厚度分別比對照組增加了4.39%和37.78%，葉脈凸起的厚度分別比對照組增加了4.09%和16.60%，柵欄組織厚度分別比對照組增加了8.06%和23.64%，海綿組織厚度分別比對照組增加了6.45%和26.96%。各輻射組與對照組間比較，在葉片的厚度、上下表皮厚度、柵欄組織厚度、海綿組織厚度和葉脈凸起厚度均差異性顯著(P<0.05)，輻射組之間比較，低劑量與高劑量輻射組間差異顯著(P<0.05)，說明60Co-γ射線輻射對苜蓿葉片的結構產生了一定的影響，特別是高劑量輻射對葉片結構影響極大。

表2 60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗莖顯微結構的特征Table 2 Stem structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

圖2 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗莖解剖結構Fig.2 Stems anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5為輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時莖的顯微結構(×40)， 6，7，8，9和10為輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時莖的顯微結構(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of stems were in order of rsdiation dose of 0,600,900,1 200,1 500 Gy(×40),and the 6,7,8,9 and 10 micrographs of the stems were in order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

表3 不同劑量60Co-γ處理下苜蓿種子的幼苗葉片結構特征Table 3 Leaf structure characteristics of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds

圖3 60Co-γ射線輻射苜蓿種子的幼苗葉片解剖結構Fig.3 Leaves anatomical structure of the seedlings of 60Co-γ radiation alfalfa seeds注：1，2，3，4和5分別為對照和輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時葉片的顯微結構(×40)， 6，7，8，9和10分別為對照和輻射劑量為0，600，900，1 200和1 500 Gy時葉片的顯微結構(×400)Note: The 1, 2, 3, 4 and 5 micrographs of the leaves were in the ovder of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×40),and 6,7,8,9 and 10 microraphs of the leaves were in the order of radiation dose of 0,600,900,1 200 and 1 500 Gy(×400)

苜蓿葉片有明顯的柵欄組織和海綿組織分化，其中葉片柵海比值、柵欄組織緊密程度和海綿組織的疏松程度見表4。不同輻射苜蓿葉片柵海比值均大于1，柵欄組織的厚度大于海綿組織的厚度。當輻射劑量為600，900，1 200，1 500 Gy時苜蓿葉片的柵海比、柵欄組織結構緊密度和海綿組織結構疏松程度均產生不同程度的影響。除輻射劑量為600 Gy時其柵海比與對照組比較增加時，其他輻射劑量的柵海比、柵欄組織結構緊密度和海綿組織結構疏松程度均有減小的變化趨勢。輻射劑量為1 500 Gy時柵海比、柵欄組織緊實密度和海綿組織的疏松度分別比對照組減小了2.67%，25.00%和26.67%。60Co-γ射線輻射對苜蓿葉片的柵海比沒有顯著影響，但對柵欄組織的緊實密度、海綿組織的疏松度產生顯著影響(P<0.05)，各輻射組之間無顯著差異。輻射對葉片的上表皮厚度、葉片的厚度、下表皮厚度和柵欄組織厚度影響大，海綿組織的厚度、柵海比值、柵欄組織緊實密度和海綿組織疏松度影響比較大，葉脈凸起厚度影響最小。

表4 葉片顯微結構參數測定結果Table 4 Determination results of leaf microstructure parameters

3 討論與結論

根是植物吸收水分和營養物質最重要的器官，也是最先感受土壤逆境脅迫最重要的部位，莖是將根吸收的水、無機鹽、以及葉制造的的有機物進行輸導，在植物生長發育的過程中經常會遇到干旱、鹽堿等不良環境條件的影響[8],植物會逐漸演化出各種各樣形態結構以適應逆境。

本研究中根莖葉的顯微結構對60Co-γ射線的輻射劑量變化的反應敏感，隨著輻射劑量的增加，苜蓿根部的表皮厚度，皮層厚度維管柱直徑、原生導管和后生導管的直徑均有增加的趨勢，這與植物對環境脅迫的響應有相似之處。如朱宇旌等[9]發現，在鹽脅迫等逆境條件下，植物可以增加表皮、皮層薄壁細胞的厚度來抑制鹽脅迫等滲透脅迫對植物根系的危害。本研究中，隨著輻射劑量增加莖的表皮厚度、皮層薄壁厚度、維管束直徑、髓直徑也均有增加的變化趨勢，劉海學等研究[10]NaCl脅迫對向日葵幼苗生長及莖組織解剖結構的影響，發現莖的解剖結構隨著鹽脅迫強度的增加而變化，薄壁細胞和皮層細胞層數明顯增多，皮層厚角組織層數也均有增加，這與本研究的結果一致。此外，隨著輻射劑量增加葉片厚度、上下表皮厚度、葉脈凸起厚度、海綿組織和柵欄組織厚度均有增加的趨勢, 柵海比有減少的變化趨勢，這與寇建村等[11]研究不同紫花苜蓿品種葉片的旱生結構和郭鵬等[12]對鹽堿脅迫下紫花苜蓿的生理學及解剖學特征的研究結果基本一致。根莖葉的顯微結構可隨著環境的變化而變化，其結構特征最能體現環境因子與植物的協同進化。通過輻射使苜蓿根和莖的輸導能力增加，葉片的光合效率增強，這可能是植物可抵御外界輻射影響的一個重要原因。

綜上所述，60Co-γ射線輻射能夠顯著影響紫花苜蓿幼苗的根莖葉顯微結構，不同劑量的60Co-γ射線輻射下苜蓿幼苗根、莖、葉顯微結構差異顯著，當輻射劑量為1 500 Gy時，與其它輻射劑量組別相比，所測各組織結構指數均達到最大值。而輻射劑量為1 800 Gy時，苜蓿干種子出苗后真葉未能長出，導致該輻射劑量下苜蓿無成苗，此輻射劑量可視為苜蓿種子60Co-γ射線輻射的致死劑量。