根瘤共生對紫花苜蓿抗寒性的影響

劉雨詩， ， ， ， *， *

(1.西北農林科技大學動物科技學院 草業科學系， 陜西 楊凌712100； 2. 陜西省草原工作站， 陜西 西安710016；3. 陜西省林業科學研究院， 陜西 西安710082)

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究采用保定紫花苜蓿(MedicagosativaL. ‘Baoding’)種子為供試材料，由中國農業科學院北京畜牧獸醫研究所提供。經1% NaClO消毒后置于鋪有濕潤濾紙的9 cm培養皿中，保持濾紙濕潤，發芽5 d后移至西北農林科技大學草業溫室中培養(溫度：晝/夜 30±5℃ / 20±5℃; 濕度：晝/夜 55±5% / 70±5%)。幼苗處理分為2組：接種苜蓿專用根瘤菌多萌(Rhizobiummelilotistrain Dormal)的紫花苜蓿(AN)和不接種根瘤菌的紫花苜蓿(NN)。AN澆改良霍格蘭氏無氮營養液，NN澆全氮營養液[27]以確保其正常生長。本課題組前期研究發現，接種根瘤菌苜蓿AN和無根瘤菌苜蓿NN的氮含量，碳含量，以及磷含量無顯著差異[28]。生長60 d的幼苗進行第一次刈割，90 d后進行第2次刈割，到120 d時，進行低溫脅迫試驗。

1.2 低溫處理

當苜蓿幼苗生長到120 d后，隨機選擇AN和NN苜蓿，放入植物培養箱進行-6℃低溫處理12 h。

1.3 樣品采集

紫花苜蓿地上部分和地下部分分別采樣，共設置7個采樣時間點，分別為低溫脅迫0 h，2 h，4 h，6 h，8 h，10 h，12 h時進行采樣。試驗設置3次重復。除電導率與葉綠素指標使用鮮樣外，其余指標測定均使用凍樣。用錫箔紙包好采集的樣品，迅速放入液氮10 min，存放于-80℃冰箱，待后續測量生理指標。

1.4 指標測定方法

1.5 數據分析

試驗數據采用SPSS 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA)統計軟件分析，獨立樣本t檢驗進行方差分析，設置相應置信區間百分比95%。使用GraphPad Prism 5作圖。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿根際狀態

不同處理下紫花苜蓿的根際結瘤狀況不同，其中AN根部有粉色根瘤，而NN根部無根瘤(見圖1)。

圖1 AN和NN根部情況Fig.1 Root situation of AN and NN注：AN表示接種根瘤菌苜蓿(紅色箭頭指出了粉色根瘤)；NN表示不接種根瘤菌苜蓿，下同Note: AN indicates activated-nodules alfalfa (Red arrows show the pink nodules in the roots of AN);NN indicates non-nodules alfalfa. The same as below

2.2 根瘤對紫花苜蓿幼苗細胞膜的影響

細胞的膜系統是植物遭遇低溫傷害的首要部位，隨脅迫時間加長，AN和NN的葉片相對電導率均呈逐漸上升趨勢。盡管NN在6 h至12 h間，葉片電導率出現波動，但總體上均高于AN。在低溫脅迫6 h、8 h、10 h時，AN的葉片電導率顯著低于NN(P<0.05)(見圖2)。

在正常生長條件下，AN和NN的丙二醛含量差異不顯著；低溫脅迫期間，2組苜蓿的地上部分和地下部分丙二醛含量都隨著脅迫時間的延長而升高，說明低溫對AN和NN細胞膜的損傷逐漸增大，并且脅迫后期，AN顯著低于NN(P<0.05)(見圖3)。

圖2 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿葉片相對電導率的影響Fig.2 Effect of nodulation on relative conductivity of alfalfa leaf under cold stress注：圖中*表示差異顯著(P<0.05)。下同Note：* indicates significant difference at the 0.05 level. The same as below

圖3 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿地上部分和地下部分丙二醛含量的影響Fig.3 Effect of nodulation on MDA content of alfalfa shoot and root under cold stress注：圖a表示地上部分，圖b表示地下部分Note: Fig.a indicates shoot part of alfalfa; Fig.b indicates root part of alfalfa

2.3 根瘤對紫花苜蓿細胞滲透勢的影響

低溫脅迫前，AN和NN的滲透勢差異不顯著。脅迫開始后，AN和NN滲透勢都呈下降趨勢。AN滲透勢6 h后下降趨勢較明顯，NN的滲透勢下降相對平緩。在脅迫4 h、8 h、10 h、12 h時，AN的滲透勢顯著低于NN(P<0.05)，在12 h低溫脅迫下， AN的滲透勢比NN低0.74 Mpa(見圖4)。

圖4 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿滲透勢的影響Fig.4 Effect of nodulation on osmotic potential of alfalfa under cold stress

2.4 根瘤對紫花苜蓿胞內活性氧積累及抗氧化劑含量的影響

低溫脅迫處理后的紫花苜蓿胞內活性氧含量增加，非酶抗氧化物質還原性谷胱甘肽(GSH)逐漸升高(見圖5、圖6與圖7)。

過氧化氫含量隨低溫脅迫時間的延長而積累。地上部分過氧化氫含量比根積累更快。脅迫6 h以后，AN地上和地下部分產生的過氧化氫顯著低于NN。在0 h時， AN地上部分的過氧化氫含量顯著高于NN，然后二者在脅迫2 h后處于同一水平，但在8 h，12 h時，NN過氧化氫含量超過AN中含量，且差異顯著(P<0.05)。地下部分低溫脅迫中，前6 h二者差異不顯著，脅迫后8 h開始，AN的過氧化氫含量顯著低于NN(P<0.05),見圖5。

超氧陰離子自由基含量隨低溫脅迫時間的延長呈波動上升趨勢。雖然AN和NN超氧陰離子自由基含量在某些時間點無顯著差異，但總體NN含量高于AN。地上部分中，NN相比AN在4 h、10 h和12 h時含量較高(P<0.05)。地下部分中，NN相比AN在4 h，6 h和12 h時含量較高(P<0.05)，見圖6。

GSH作為非酶氧化清除劑，隨脅迫時間延長，在植物體內含量逐漸增加。低溫脅迫6 h后，AN體內積累更多的GSH。AN地上部分GSH含量在脅迫6 h、8 h、10 h時顯著高于NN，分別為NN的1.25，1.12和1.37倍(P<0.05)；AN根中GSH含量在處理6 h、8 h、12 h時顯著高于NN，分別為NN的1.33，2.33和1.28倍(P<0.05)，見圖7。

試驗中隨低溫脅迫時間延長，AN和NN的VC含量呈下降趨勢，但與NN相比，AN中VC含量更高。根瘤菌處理組AN地上部分的VC含量在4 h、10 h、12 h時顯著高于NN(P<0.05)，地下部分VC含量在2 h時顯著高于NN(P<0.05)(見圖8)。

圖5 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿過氧化氫含量的影響Fig.5 Effect of nodulation on hydrogen peroxide content of alfalfa shoot and root under cold stress注：a表示地上部分，b表示地下部分Note: a indicates shoot part of alfalfa; b indicates root part of alfalfa

圖6 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿超氧陰離子自由基含量的影響Fig.6 Effect of nodulation on superoxide anion radical content of alfalfa shoot and root under cold stress

圖7 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿還原性谷胱甘肽含量的影響Fig.7 Effect of nodulation on GSH content of alfalfa shoot and root under cold stress

圖8 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿抗壞血酸VC含量的影響Fig.8 Effect of nodulation on VC content of alfalfa shoot and root under cold stress

2.5 根瘤對紫花苜蓿葉綠素含量的影響

低溫脅迫后，AN葉綠素含量先增加后減少；NN葉綠素含量先減少，后略微增加，又減少，總體呈下降趨勢。AN的葉綠素a含量在4 h、6 h、8 h時顯著高于NN(P<0.05)；處理組AN的葉綠素b含量在4 h、6 h時顯著高于NN(P<0.05)；與NN相比，AN的葉綠素總量在脅迫中期維持在較高水平，在4 h和8 h時二者差異顯著(P<0.05)(圖9)。

圖9 低溫脅迫下根瘤對紫花苜蓿葉綠素a，b及葉綠素總量的影響Fig.9 Effect of nodulation on chlorophyll a, b and total chlorophyll content of alfalfa shoot under cold stress注：a表示葉綠素a含量；b表示葉綠素b含量；c表示葉綠素總含量Note: a indicates the chlorophyll a content; b indicates the chlorophyll b content; c indicates the total chlorophyll content

3 討論

低溫逆境下植物細胞的膜系統首先受到損傷。膜上不飽和脂肪酸氧化降解，膜孔隙變大，胞內離子外滲，相對電導率升高，故常通過相對電導率的變化判斷細胞膜受傷害情況，越高的相對電導率預示著膜系統受損越嚴重[36]。本研究發現低溫脅迫后，電導率含量升高，但AN的電導率較NN的要低，說明NN植物細胞內有更多的離子外滲，與李莎莎等[27]關于根瘤共生苜蓿在低溫脅迫下電導率變化研究結果一致。MDA是細胞膜膜脂過氧化的產物之一，能強烈的與胞內各物質反應，它的積累還會進一步加劇對酶和膜的損傷，所以抗逆生理研究中也常用MDA作為氧化損傷指標[37-39]。AN和NN的MDA含量隨脅迫時間延長逐漸上升，但NN的MDA積累速率明顯快于AN，說明相對于不接種根瘤菌的紫花苜蓿NN，接種根瘤菌紫花苜蓿AN 能降低MDA產生速率以減少因低溫造成的細胞膜損傷。

低溫脅迫下，植物自身會產生大量滲透調節物質，引起植物葉片滲透勢降低；滲透勢越低的植物在逆境中的調節能力越強[40]。在持續低溫脅迫下，AN比NN保持更低的滲透勢，說明紫花苜蓿在根瘤共生的情況下，對外界脅迫產生了更快更強的滲透保護作用，能更好的維持自身細胞膜穩定性。

正常生長條件下，植物體內自由基的產生與清除處于動態平衡的穩態中，當植物遭遇脅迫時，這種穩態會被打破，導致自由基在胞內迅速積累，清除劑含量下降，破壞膜質的雙層結構，對細胞膜系統造成損傷，促使植物細胞膜脂質過氧化，抑制植物生長[41]。活性氧分子如超氧陰離子自由基與過氧化氫的累積會導致植物細胞氧化損傷[42]。低溫脅迫下，AN比NN具有較低的過氧化氫含量和超氧陰離子自由基含量，表明根瘤菌共生能在一定程度上抑制活性氧的產生。自由基的大量積累，會使不飽和脂肪酸鏈降解，破壞細胞膜，致使MDA積累，電解質滲出[43-44]，這與本試驗研究發現的脅迫后NN積累更多活性氧自由基，產生更多MDA含量和相對電導率的結果相一致，說明根瘤與紫花苜蓿互作后，能增加苜蓿細胞內環境的穩定性。

抗逆性強的植株比抗逆性弱的植株擁有更高的抗氧化劑水平[45-46]。當植物遭受脅迫后，GSH含量的提高，可抑制不飽和脂肪酸生物膜分解，清除氧化劑羥基和H2O2，防止膜質過氧化，增強植物抗逆性[47]。已有研究結果表明，耐低溫轉基因番茄比野生型番茄在低溫下產生更高的GSH含量[48]。本試驗結果表明，在低溫脅迫6 h后，根瘤固氮的AN苜蓿，GSH含量顯著升高并維持在高水平，這說明與根瘤互作后，GSH含量能在植物遭受低溫脅迫后顯著升高，增強苜蓿的耐寒性。

VC是植物體內的一種重要維生素，同時具有抗氧化作用，其含量的多少與植物營養價值、抗逆、抗衰老能力相關，不適宜的溫度將導致VC含量下降[49]。本研究中AN和NN在根際中的VC含量于脅迫后期大致相當，但在地上部分中，AN的VC含量在脅迫后期顯著比NN中的含量高，表明在較長時間的低溫下，根瘤固氮可以在一定程度范圍內延緩植物VC含量的損失，緩解植物在逆境下的不利狀態。

低溫則影響植物的光合作用。葉綠素作為參與光合作用的核心物質，在低溫下會被抑制生物合成，含量降低，常用來反應植株葉片受脅迫程度[50-51]。本試驗在同等脅迫情況下，與根瘤菌共生的苜蓿植株較不接種根瘤菌的植株，表現出更緩慢的葉綠素分解速度，這說明接種根瘤菌在一定程度上能降低低溫脅迫給植物葉片帶來的損傷，延緩低溫導致的葉片光合損失。

4 結論

與根瘤菌共生結瘤固氮一定程度上能增加紫花苜蓿的滲透調節能力，維持光合作用水平和氧化物清除能力，從而提高紫花苜蓿對低溫脅迫環境的抵抗力，有助于提高紫花苜蓿在寒冷地區的生存能力。