通絡駐景丸對糖尿病大鼠視網膜VEGF及其mRNA表達的影響

任翠翠 ，周云云 ，李高彪 ，李雨薇 ，艾華 ，雷曉琴

糖尿病性視網膜病變（Diabetic retinopathy，DR）是糖尿病（diabetes mellitus，DM）最常見、最具破壞性的微血管病變，是臨床常見的致盲性眼病之一。預計到2030年，全球DR的發病人數上升到1.9億[1-3]。增殖性糖尿病視網膜病變 （proliferative diabetic retinopathy，PDR）是DR發展的一個嚴重階段，以形成新生血管為主要特點，血管內皮生長因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF） 是主要的促血管增生因子[4]。抗新生血管的生成對PDR的治療至關重要[5-6]。通絡駐景丸是在駐景丸的基礎上由雷曉琴教授優化而成，對DR療效確切[7]，并進行了深入的相關實驗研究[8-9]。因此，本實驗進一步從抗VEGF角度，探討通絡駐景丸干預糖尿病大鼠視網膜病變的作用機制，為該方的臨床應用和進一步研究提供依據。

1 材料與方法

1.1 動物

雄性SD健康大鼠，體重180~220 g，購于西安交通大學醫學部實驗動物中心，許可證號：SCXK（陜）2014-003。

1.2 試劑與藥物

通絡駐景丸（組成：熟地、菟絲子、車前子、三七、蒲黃、砂仁、地龍等），規格 10 粒/g，批號：20160406，西安交通大學醫學部藥學院提供。鏈脲佐菌素（CAS：18883-66-4，Sigma， 美國）；DAB 顯色試劑盒（博士德生物技術有限公司，武漢）。兔抗小鼠VEGF單克隆抗體（中山生物技術有限公司，中山），VEGF ELISA 試劑盒（RapidBio，CA）等。

1.3 實驗儀器

羅氏血糖儀和卓越金銳血糖試紙 （羅氏診斷有限公司，德國），Olympus BX51-DP71顯微鏡（Olympus，日本），電子天平（民橋精密科學儀器有限公司，上海）。

1.4 造模和分組

健康雄性SD大鼠適應性飼養一周，隨機選取15只為空白對照組 （NC組），其余大鼠腹腔注射STZ造模。按1%STZ溶解于新鮮配制的檸檬酸緩沖液中，60 mg/kg體質量腹腔注射誘發糖尿病。NC組按60 mg/kg體質量腹腔注射檸檬酸緩沖液。整個過程無菌操作，10 min內完成。注射后30 min恢復進食。72 h后大鼠尾靜脈采血測量血糖，剔除隨機血糖低于16.7 mmol/L的大鼠。取造模成功的大鼠隨機分為4組：模型組（DM組），通絡駐景丸低、中、高劑量組（TLP-L組、TLP-M組、TLP-H組），每組15只。DM和NC組給予蒸餾水，TLP-L、TLP-M和TLP-H組分別按照通絡駐景丸1.65 g生藥/kg、3.33 g生藥/kg、6.66 g生藥/kg灌胃給藥，給藥容積2 ml/100 g體質量。每日灌胃一次，連續12周。

2 實驗方法

2.1 血清中VEGF水平測定

末次給藥1 h后，腹主動脈取血，室溫靜置2 h后3500 r/min離心分離血清，使用ELISA試劑盒測定血清中VEGF含量表達。具體步驟按照VEGF試劑盒說明書進行。

2.2 視網膜內VEGF mRNA表達檢測

腹主動脈取血后，立即摘取眼球，一半眼球剝離視網膜后置-80℃冰箱保存，另一半用于免疫組化實驗。采用熒光實時定量PCR法測定大鼠視網膜組織內VEGF mRNA表達的影響。VEGF mRNA表達以β-actin為內標來測算。引物序列見表1。

表1 Real-time-PCR引物序列

2.3 視網膜VEGF免疫組化檢測

取上述2.2中的眼球，置多聚甲醛溶液中固定12 h，剝取視網膜，用于免疫組化實驗。用SABC免疫組織化學染色試劑盒檢測，具體操作步驟：①脫蠟和水化；②1份3%H2O2加蒸餾水10份混合，滴加在切片上，室溫靜置10 min；③抗原修復；④滴加5%BSA封閉液；⑤滴加一抗Anti-VEGF，4℃過夜；⑥滴加生物素化山羊抗小鼠IgG；⑦滴加試劑SABC；⑧DAB顯色；⑨蘇木精復染，脫水、透明、封片、鏡檢。通過圖象分析系統進行量化分析。

2.4 統計分析

實驗數據用SPSS 17.0統計軟件分析，各組數據均為計量資料，組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若p＜0.05，則認為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 血清中VEGF水平

與空白組相比，模型組中大鼠血清VEGF水平顯著升高（p＜0.01），而給予不同劑量的通絡駐景丸干預后，VEGF水平均有不同程度下降，其中，通絡駐景丸高、中劑量組降幅最大（p＜0.01），見圖 1。

圖1 通絡駐景丸對糖尿病大鼠血清VEGF水平的影響

3.2 視網膜VEGF mRNA表達水平

與空白組相比，模型組大鼠視網膜VEGF mRNA的表達顯著升高（p＜0.01）。與模型組相比，不同劑量通絡駐景丸組VEGF mRNA均有不同程度的降低，且通絡駐景丸高、中劑量組降幅顯著（p＜0.01），見圖2。

圖2 通絡駐景丸對DR大鼠視網膜VEGF mRNA表達水平的影響

3.3 視網膜VEGF免疫組化

經免疫組化染色后，糖尿病大鼠視網膜上VEGF陽性表達呈現出深棕褐色著色顆粒。空白組主要在神經節細胞層中有弱的VEGF表達。與空白組相比，模型組在神經節細胞層、內叢狀層及內核層外核層都有VEGF的較強表達（p＜0.01）。與模型組相比，通絡駐景丸低劑量組VEGF的表達減弱（p＜0.05），通絡駐景丸中、高劑量組表達減弱更顯著（p＜0.01），提示通絡駐景丸可減少糖尿病大鼠視網膜中VEGF的表達，見圖3。

圖3 DR大鼠視網膜VEGF免疫組化結果

4 討論

PDR是一種以眼底視網膜新生血管形成為主要標志的糖尿病微血管并發癥之一[10]。通常，DR被認為是一種細胞增殖性疾病，它的發生、發展和細胞的激活與增殖調控密切相關，新生血管本身也是細胞異常增殖的一種結果[11-12]。在眾多血管生長因子中，VEGF是目前公認的最主要的促血管生長因子。研究認為，視網膜多種細胞，包括視網膜色素上皮細胞、Müller細胞、血管內皮細胞都能夠產生VEGF[13-14]。正常生理狀態下，視網膜內VEGF保持在較低的水平[15]。當機體維持在長期高血糖狀態時，視網膜組織出現缺血缺氧，進一步激活VEGF的表達，從而引起內皮細胞增殖、血管管腔狹窄和閉塞、血流動力學改變，最終導致新生血管形成，DR病程不斷惡化[16]。研究表明，糖尿病大鼠VEGF水平的降低可使增殖性糖尿病大鼠視網膜病變得到明顯改善[17]。

中醫認為，DR病機多為氣血陰陽失調，以氣陰兩虛、肝腎不足、陰陽兩虛為本，脈絡瘀阻、痰濁凝滯為標。通絡駐景丸源于中醫經典古方駐景丸，雷曉琴教授基于對駐景丸、加減駐景丸、駐景丸加減方的深入研究、臨床應用和動物實驗的不斷探索總結的基礎上，創制形成通絡駐景丸[18]。通絡駐景丸具有滋陰活血、化瘀止血、通絡明目之效，方中熟地黃、菟絲子滋陰補腎、養肝明目，車前子清虛熱而明目，三七、蒲黃活血化瘀，墨旱蓮滋補肝腎、涼血止血，砂仁化濕行氣，地龍通經入絡。諸藥合用，共成滋補肝腎，化瘀止血之功，具有穩定血管內環境，發揮減輕DR病癥的作用[19]。

課題組前期研究發現，通絡駐景丸可有效減輕DM大鼠視網膜組織氧化應激損傷、抑制視網膜增殖，這一機制可能與Nrf2/ARE通路的激活以及Nrf2、HO-1蛋白表達有關[20]。本實驗在前期研究基礎上，通過鏈脲佐菌素（STZ）誘導大鼠糖尿病視網膜病變，進一步探討通絡駐景丸干預糖尿病大鼠視網膜VEGF表達的作用。結果顯示，通絡駐景丸干預12周后，大鼠血清中VEGF水平均顯示不同程度的降低，且在視網膜組織中，VEGF mRNA和VEGF蛋白表達也顯著降低，這種降低趨勢呈現明顯的量效關系，其中以高劑量組最為顯著。提示通絡駐景丸可以降低糖尿病大鼠血清和視網膜組織中VEGF水平，從而發揮抵抗新生血管生成的作用，延緩DR的病程的發展。

綜上所述，本實驗初步研究表明通絡駐景丸能夠在mRNA和蛋白表達水平顯著降低糖尿病大鼠視網膜中VEGF水平，發揮抗新生血管作用，為通絡駐景丸進一步應用與臨床治療提供實驗依據。