荒漠植物沙鞭(Psammochloa villosa)種質資源收集及譜系遺傳分化初探

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(青海師范大學，青海省青藏高原藥用動植物資源重點實驗室，青海省自然地理與環境過程重點實驗室，青藏高原環境與資源教育部重點實驗室，青海 西寧 810008)

沙鞭(PsammochloavillosaBor.)是禾本科(Poaceae)、針茅族(Stipeae)、沙鞭屬(Psammochloa)的一種多年生草本植物，主要分布于我國內蒙古高原及其毗鄰沙區，如巴丹吉林沙漠、馬蘭布和沙漠、騰格里沙漠、庫布齊沙漠、毛烏素沙地及甘肅河西走廊沙區、寧夏中北部和陜西北部沙區[1-2]，是這些極端沙地環境下分布的關鍵或唯一草本物種，不僅具有重要的生態價值，而且也是我國沙漠地區重要的優勢牧草。沙鞭是單種屬沙鞭屬的一個模式種，最初系由Hitchcock[3]于1927年基于館藏在美國自然歷史博物館的兩份模式標本而發表的一個新物種，命名為PsammochloamongolicaHitchc.，這個物種得到我國諸多學者的普遍接受與認可[4-5]。此后，諸多學者對沙鞭的系統位置和物種名稱進行了多次歸隸和修訂，尤其是1951年Bor[6]將沙鞭種名重新修訂為PsammochloavillosaBor.，并詳細闡述了其外部形態特征、生境及地理分布，是沙鞭分類學上的一個里程碑，特別是這些新的描述和修訂至今仍被國內外絕大多數學者普遍采用[1-2,7-8]。沙鞭具長而橫走的根狀莖，圓錐花序緊密直立，小穗具有短柄、淡黃色或白色，外稃密被長柔毛等特征，主要通過克隆繁殖進行后代繁育，具有很強的建群能力，是我國內蒙古沙地及其毗鄰地區的先鋒植物和建群草本物種；對流動沙丘具有很強的適應性，是沙地植物群聚的優勢種，是典型的旱生和沙生植物，對維持這一區域內的生態系統平衡具有不可低估的作用[2,7]。此外，沙鞭具有較強的耐旱、耐寒、耐堿以及抗病和抗風沙能力，加之花序相對粗長、穗多粒大等優點，是農牧業上禾草良種繁育和牧草利用的重要基因資源。

目前，國內外學者已從形態學、生理學、生態學等方面對沙鞭進行了研究報道。在形態學方面，董鳴[9]通過切斷根莖對根莖禾草沙鞭和賴草克隆生長影響的比較研究，發現斷莖處理對沙鞭基株的根莖、地上枝、主根莖等相關性狀特征增量顯著降低，但對沙生植物賴草卻幾乎無影響，表明沙鞭的克隆整合和生長特性賦予其在極端惡劣沙生環境中的生存能力；在生理學方面，黃振英等[10]通過對沙鞭種子在沙丘上萌發策略及幼苗耐干燥特性的研究表明，隨著沙埋深度的增加，其種子萌發率和幼苗出土率下降；在生態學方面，徐翥驊等[11]通過對沙鞭和羊柴不同根圍的土層土壤樣品進行AM真菌空間分布及其與土壤因子的相關性研究，發現AM真菌能與沙鞭和羊柴形成良好共生關系；但關于荒漠植物沙鞭遺傳多樣性的研究起步較晚且報道甚少，僅見王可青等[12]采用等位酶電泳技術，對毛烏素沙地沙鞭種群進行了遺傳多樣性研究，發現沙鞭遺傳變異水平低于同類植物，并且絕大多數遺傳變異存在于種群間；此后，Li[13]利用ISSR分子標記技術，對來源于我國西北地區7個沙鞭種群的遺傳變異和克隆多樣性進行了研究，發現沙鞭天然種群的遺傳變異水平較高，種群間遺傳分化遠大于種群內，同時還發現利用ISSR分子標記技術獲得的沙鞭遺傳多樣性參數值比利用等位酶電泳技術得到的數值準確、可靠。上述研究不僅對系統評價沙鞭的抗旱性，篩選抗旱性強、表現好的種質資源提供了重要理論依據，而且能夠促進牧草品種改良和抗逆性篩選，并為揭示克隆植物與沙生環境關系及其潛在進化意義提供基礎資料。據此，本文研究集中在內蒙古高原及其毗鄰地區調查沙鞭的具體自然地理分布、種質資源收集結果以及初步利用nrITS序列進行的遺傳分化研究，旨在為沙鞭未來的研究和資源利用提供科學合理的資料。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料全部來源于野外采集的新鮮幼嫩、無病蟲害，用硅膠干燥的沙鞭葉片，從采集材料中選取具有代表性的60個沙鞭種群，再從每個種群材料中選擇3個具有標準形態和代表性的個體作為研究材料，進行nrITS序列的擴增和測序。此外，本研究選擇絲穎針茅(Stipacapillacea)作為外類群。

1.2 試驗方法

1.2.1野外調查和群體采樣 在廣泛查閱現有沙鞭文獻資料，中國科學院西北高原生物研究所青藏高原生物標本館(HNWP)、中國科學院植物研究所標本館(PE)等館藏標本，以及中國數字植物標本，地方植物志和各類野外調查研究結果對荒漠植物沙鞭天然分布產地記錄基礎上，詳細標記其產地，發現荒漠植物沙鞭主要分布于我國內蒙古高原的幾個沙地，因此將上述所有標本采集地視為重點采集區域，并對所有地點進行群體采樣，同時對其毗鄰地區是否有該物種分布也進行較為全面的野外調查和群體采樣；具體調查范圍為37°25'29.1''～43°7'11.8'' N，104°40'5.0''～112°54'23.5'' E，海拔976～1 707 m。發現沙鞭典型種群進行GPS定位，同時詳細記錄每個種群的生態因子信息(如年平均溫度、年降水量、經緯度、海拔高度等)，并注意觀察其生長環境(如溫度、坡度、坡向及土壤等)。

1.2.2nrITS提取、擴增和數據分析 本研究采用改進的CTAB法[14]，從硅膠干燥的沙鞭植物葉片中提取全基因組DNA；然后，選用引物ITS1和ITS4進行nrITS序列的擴增和測序，引物序列為ITS1：5′-AGAAGTCGTAACAAGGTTTCCGTAGG-3′，ITS4：5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'；PCR擴增的反應體系和反應條件參考劉玉萍[15]、王倩[16]等學者的相關研究內容。擴增反應是在ABI公司生產的ABI 9700 PCR儀上進行，利用1%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行檢測(圖 1)，PCR產物由北京華大基因測序有限公司進行常規測序。所有序列用軟件Clustal X 1.81[17]和進行比對并加以手工校對；DnaSP 5.0軟件[18]統計每個片段的插入缺失和單核苷酸多態性；采用啟發式搜索和MrBayes 3.1[19]進行系統發育樹的構建和分析，并檢驗它們之間的遺傳差異，給出重復1 000次各分支的自展支持率BV(bootstrap value)值和貝葉斯系統樹(bayesian inference，BI)后驗概率PP值。

圖1 PCR產物凝膠電泳圖Fig.1 The gel electrophoresis of nrITS PCR product注：DNA marker為2000bp。從上到下由2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp以及100bp共6條雙鏈DNA片段組成Note：DNA marker is 2000bp. From top to bottom, there are 6 double-stranded DNA fragments of 2000bp, 1000bp, 750bp, 500bp, 250bp and 100bp

2 結果與分析

通過我們2013-2016年的詳細調查，目前已經收集到中國甘肅、寧夏、陜西以及內蒙古等絕大多數野外自然地理分布區的沙鞭種群種質資源材料，共有60個種群(圖2)，每個種群收集到5～10株，間隔200 m以上，其中包括450個的個體DNA材料、以及45個種群的成熟種子，每個種群采集不少于5個的個體材料為憑證標本。此外，我們對沙鞭60個種群的采集地、經緯度、海拔和生境等也作了詳細記錄(表1)。上述所有憑證標本、DNA種群樣品和成熟種子等均暫且保存于青海師范大學青藏高原植物標本室(QHNUBI)。

圖2 沙鞭種質資源采集地理分布圖Fig.2 Sampling locations of Psammochloa villosa in the Inner Mongolian Plateau

表1 沙鞭種質資源采集信息表Table 1 Sampling information of Psammochloa villosa

續表1

續表1

注：NX，寧夏；NMG，內蒙古；SX，陜西

Note: NX, Ningxia; NMG, Neimenggu; SX, Shanxi

基于nrITS序列構建的系統發育樹結果表明，兩種方法構建的系統發育樹拓撲結構極為相同，只是支持率略有不同(圖3)；同時，我們還發現所有參試種群核糖體核基因序列存在顯著差異，將它們分成兩個較為明顯的譜系遺傳分支，即一個分支(A)主要由生長于內蒙古高原東部的所測個體構成，并在兩種方法中得到100%的BV值和100%的PP值；另一分支(B)主要由采自內蒙古高原西部的所測個體組成，在兩種方法中也得到較高支持率100%的BV值和100%的PP值。

3 討論

核基因組核糖體DNA內轉錄間隔區(nuclear ribosomal internal transcribed spacer，nrITS)已經成為被子植物特別是較低分類階元分子系統學、譜系地理學和生物多樣性研究中應用最為廣泛的一個核核糖體片段，尤其是它現已發展成為種子植物DNA條形碼的核心條形碼[20]。通常nrITS片段不僅長度穩定和通用性好[21]，而且變異速率較高，能夠提供較豐富的遺傳變異信息位點[22]，因而它已被國內外諸多學者普遍用來從分子水平上探討植物的譜系遺傳分化研究，并取得一系列研究成效[23-25]。沙鞭作為一種重要的防風固沙植物種質資源，它已經引起廣泛關注，并對其開展了種子萌發特性、克隆生長特點、遺傳多樣性等方面的諸多研究，本研究團隊也已對其主要自然地理分布區的種質資源進行了3年的野外調查和群體采樣。據此，利用nrITS序列對沙鞭已有種群材料進行了相關研究。結果發現沙鞭的所有參試類群構成一個單系，nrITS序列間存在顯著差異，能將它們分成較為明顯的譜系遺傳分支， 表明該物種種群間遺傳分化顯著，這可能與其對不同荒漠條件具有較強適應能力有關。在野外調查和群體采樣中也發現，內蒙古高原東西部的沙鞭種群在植株高度、葉片被毛狀況、圓錐花序和小穗長度、外稃被毛等許多外部形態特征上存在著較大差異。荒漠植物沙鞭的遺傳分化、種群動態及分布式樣等科學問題需要以后完成全面野外調查和群體采樣，并在種群水平上對多種遺傳背景分子數據綜合分析和模擬后，才能闡明全球氣候變化尤其是第四紀冰期是如何深刻影響我國西北干旱荒漠區荒漠植物沙鞭種群遺傳結構、遺傳分化及種群動態歷史的原因。

因此，能夠開展和需要完成研究工作主要包括：⑴通過群體水平上廣義形態性狀的統計分析，闡明沙鞭種群內和種群間遺傳多樣性及其空間分布格局，尋找引起沙鞭變異的主要表型性狀，探討沙鞭表型性狀變異、以及其與地理和生態因子之間的相關性。⑵模擬干旱梯度脅迫，對沙鞭種子萌發期和幼苗期進行抗旱性研究，篩選抗逆性強的優良種質資源種群。⑶利用不同類型的分子標記，從群體水平上比較和評價沙鞭的遺傳多樣性，探討其遺傳多樣性特點和遺傳結構模式。⑷采用多種不同遺傳背景分子標記的聯合分析，并利用生態位(ENM)模擬相結合的方法，系統探討沙鞭種群遺傳變異的地理分布式樣，結合現代植物分子群體遺傳學分析方法，全面追述其現代分布種群的進化歷史、分布格局形成的歷史原因、溫度下降時的避難所以及回升后的擴散/回遷路線。并且還可利用已采集的沙鞭種質資源材料，采用比較基因組學等分子生物學和遺傳學方法，研究和提取沙鞭的優良抗逆基因，然后通過轉基因技術將其轉入到其它禾本科牧草(如披堿草、針茅)和農作物 (如小麥、玉米、青稞)中，篩選培育適合不同用途且抗逆性強的新品種。總之，通過長時間全面系統的野外考察和群體采樣，目前本研究團隊已經收集到較為完整的沙鞭種質資源，不僅為其不同基因型多個種群種質資源的收集和整理提供了材料基礎，而且也為今后研究和利用這些種質資源提供了保證。

圖3 基于nrITS序列數據構建的最大簡約樹和Bayesian 50%多數規則一致性樹，分支上數字分別代表最簡約樹(MP)的自展支持率和Bayesian后驗概率Fig.3 The most parsimonious tree based on nrITS sequences and 50% of Bayesian majority rule consensus tree based on nrITS sequences. Numbers above the branches indicate bootstrap support and the Bayesian posterior probabilities respectively

4 結論

本研究通過對沙鞭廣泛的野外考察，共采集沙鞭60個種群的憑證標本、450個的個體DNA材料及45個種群的成熟種子；同時，本文還利用DNA分子標記對沙鞭譜系分化進行了初步探討，發現沙鞭種群存在明顯的遺傳分化，可能與內蒙古高原特殊的地理氣候條件有關。因此，這種系統種群水平上沙鞭種質資源的材料收集，對今后探討沙鞭的遺傳多樣性及其分布格局、適應進化和分布擴散、抗旱適應性生理生態機制、以及響應第四紀氣候變遷的生物地理學模式提供重要基礎。