食品中黃曲霉毒素的污染與檢測

谷怡靜

（河北農業大學理工學院，河北滄州 061100）

曲霉廣泛分布于空氣、土壤、谷物和各類生物中，在一定的濕度和溫度條件下，會引起食品的霉變。曲霉毒素是真菌毒素中首先發現的一種，文中談到的黃曲霉毒素就是曲霉毒素中最重要的一種。1960年，英國倫敦郊區發生的“火雞X病”使黃曲霉毒素首次被發現，其常見于谷物和糧油制品的污染。由于黃曲霉毒素具有強烈的致癌性，嚴重威脅了人類健康，所以研究食品中黃曲霉毒素的污染并對食品中黃曲霉毒素含量的檢測十分必要。

1 黃曲霉毒素的分布與結構

1.1 黃曲霉毒素的分布

黃曲霉毒素是黃曲霉和寄生曲霉污染食品后滋生的一種強力毒素。這2種霉菌在自然界中普遍存在，尤其是在花生、玉米和小麥等植物性的食物中多見。黃曲霉毒素對食品的污染及污染程度因地域、季節、作物生長、儲存的條件不同而不同。在南方高溫高濕等環境中，春夏兩季黃曲霉毒素中毒頻繁發生，而華北等北方地區，除個別樣品外，一般樣品中檢測不到黃曲霉毒素。

1.2 黃曲霉毒素的結構

黃曲霉毒素是具有相似結構的多種毒素化合物的總稱，每種化合物在其基本結構中均含有雙氫呋喃環和氧雜萘鄰酮。大致可分為B類和G類，以及其在人體內羥基化后產生的代謝產物M類。在這些類型中，黃曲霉毒素B1（AFB1）毒性最強、致癌性最強。

AFB1的分子結構式見圖1。

圖1 AFB1的分子結構式

2 黃曲霉毒素的產生與理化性質

2.1 黃曲霉毒素的產生

產生黃曲霉毒素的最適溫度11～37℃，相對濕度80%～85%，pH值在4.0以下。當溫度處于24～30℃時，能產生黃曲霉毒素的最低相對濕度83%，并且在這種條件下黃曲霉菌的產毒量達到最高。當霉菌處于氧氣含量充足、低溫、有微量元素的含糖量高的物質中并且與其他霉菌競爭激烈時，黃曲霉可以在2 d內快速生長并產出黃曲霉毒素。

黃曲霉毒素對農作物的污染一般集中在其還未成熟期，即在田間生長階段。當作物收獲后由于不良的貯藏條件或所處環境濕度較高，會導致霉菌爆發，從而使農作物被毒素污染。這些霉菌廣泛存在于土壤、動植物、各種堅果中，特別是以花生和核桃中最為嚴重。通常情況下，水分高于14%最適合黃曲霉的繁殖和生長。

2.2 黃曲霉毒素的理化性質

黃曲霉毒素在適當的紫外光照射下發射高強度熒光。黃曲霉毒素水溶性極差，難溶于水且幾乎不溶于己烷、石油醚、乙醚等溶劑。但溶于甲醇、油、丙酮、二甲基甲酰等有機溶劑中。黃曲霉毒素的熱穩定性較好，不易受熱分解，分解溫度高達280℃，想要使其失活必須通過長時間的高溫作用（即溫度達到100～120℃后持續加熱），例如高壓消毒和煅燒。若想要進一步破壞毒素的活性，也可用NaOH萃取其中的游離脂肪酸。

3 黃曲霉毒素的殘留限量

一般來說，毒素能否對人類的身體健康造成危害取決于毒素在所食品中所占比例。黃曲霉毒素B1是到目前為止發現的具備最大毒性的一種真菌毒素，因此對黃曲霉毒素的許可殘留量進行了相關規定：規定大米和食用油中黃曲霉毒素的允許殘留量不得超過10μg/kg，其他食品、豆類及發酵食品中不得超過5μg/kg，嬰兒代乳食品（配方奶粉）中不得檢出黃曲霉毒素。WTO（世界衛生組織） 給出建議：食品和飼料中黃曲霉毒素的最大殘留量不應超過15 μg/kg。

我國標準規定的黃曲霉毒素的允許量[1]見表1。

表1 我國標準規定的黃曲霉毒素的允許量

4 黃曲霉毒素的危害

黃曲霉毒素為高毒性，有研究表明，其毒性相當于砒霜（砷）的68倍，敵敵畏的100倍，會對人體和動物的肝臟、腎臟造成極大的危害，并可能使人體器官發生癌變，有很大的幾率引發腫瘤。

4.1 急性慢性中毒

黃曲霉毒素主要作用于肝臟并直接抑制DNA，RNA和肝臟蛋白質的合成。急性中毒后會有肝出血、肝臟損傷等現象，并使中毒者食欲明顯減弱從而導致體重下降、生長緩慢，如果長時間中毒未處理則會伴隨抽搐、過度興奮等癥狀。若是由于持續攝入微量毒素而引起的慢性（亞急性） 中毒可以對動物的生長造成障礙或使肝臟出現慢性損傷等癥狀。

4.2 致癌性

黃曲霉毒素可誘發肝癌的發生。其誘發肝癌是通過人體長期攝入少量或短期攝入大量毒素造成的。其中以AFB1的致癌能力最強，AFG1和AFM1次之。王慶峰等人[2]研究發現，當乙型肝炎病毒的攜帶者或大部分吸煙者發生黃曲霉毒素中毒時，這2種疾?。ú《九c毒素）會發生協同作用，使肝癌的發生率明顯增高。

4.3 其他毒性

在其他毒性中，以胚胎毒性最為嚴重。當黃曲霉毒素對肝臟造成直接傷害后，可導致遺傳基因畸變，致畸胎或死胎。

5 黃曲霉毒素的檢測方法

近幾年來，隨著黃曲霉毒素研究方法的不斷完善，檢測技術的靈敏度與檢測結果的精密度不斷提高，出現了許多快速檢測方法。主要有薄層色譜分析法（TLC）、高效液相色譜法（HPLC）、免疫化學分析法和生物傳感器技術。這些新方法和新技術的廣泛應用與發展使得人們在檢測黃曲霉毒素方面有了更多的選擇。針對檢測的不同目的與要求可以更好地選擇所適用的技術。

5.1 薄層色譜分析法（TLC）

目前，國內大部分檢測機構都采用薄層色譜法檢測黃曲霉毒素，這也是國家標準推薦的方法。唐志峰等人[3]認為這種方法是依據分子分離的方式檢測的，主要是利用儀器作為基礎設備進行掃描，以獲取其中的黃曲霉毒素含量，這是基于傳統視覺檢測方法不斷改進和創新的結果。其基本原理是用適當的萃取劑從樣品中萃取出AFB1，濃縮、純化并在薄層板（色譜）上展開層析、分離，接著在紫外光下激發顯色，利用AFT的熒光性進行定量判斷。根據樣品在紫外光下的熒光點的強度，與標準品的熒光點相比，以此來確定黃曲霉毒素在樣品中的含量是否超標，為半定量分析方法。這種分析方法的優點是所需設備簡單、操作方便，一般的檢測實驗室即可完成測定。缺點是樣品前處理復雜、操作繁瑣、費時費力、測定的干擾因素多，所得結果的準確性差、誤差較大。最重要的一點是該方法的最低檢出限為5μg/kg，與國標上的毒性安全劑量0.01μg/kg[4]相比所需試劑量過多，所以這種檢測方法會間接對操作人員的身體造成傷害，已經逐漸被其他方法替代。

5.2 高效液相色譜法（HPLC）

高效液相色譜（HPLC）是一種利用液體作為流動相的新型液相色譜檢測技術。該方法已被廣泛應用于國內外黃曲霉毒素的檢測中。步驟一般分為提取、凈化和檢測。其原理是樣品經凈化后，在適當的流動相下，使用反相C18色譜柱，根據分離組分在流動相和固定相中的溶解度不同而將樣品中的AFT分離出來，達到分離目的。根據分離情況的不同可形成一定的色譜峰，通過測量色譜峰的面積從而做到對AFT的定量分析[5]。李紅梅等人[6]通過加入標液從而得到峰面積與濃度的一條標準曲線，并發現AFB1在5～100 ng/mL線性關系比較穩定，如果信噪比3為標準，則HPLC對AFB1的檢出限為1 ng/mL。趙群等人[7]利用此方法測定玉米中的黃曲霉毒素時，發現樣品中峰全部出完僅需5 min，耗時非常短并且測出當加標測定玉米中的黃曲霉毒素時，玉米樣品加標回收率可達到93.9%～104.4%。孟之航等人[8]更是由此方法檢測了20多種堅果，其中都未發現黃曲霉毒素，而玉米被黃曲霉毒素污染的程度高達36%。高效液相色譜法檢測結果誤差小、靈敏度高、操作方便、數據可靠，但是儀器、試劑比較昂貴?，F在人們正在不斷的研究此方法，使這個方法可以運用更加廣泛。

TLC與HPLC 2種方法的比較[9]見表2。

表2 TLC與HPLC 2種方法的比較

5.3 免疫化學分析法

5.3.1 酶聯免疫吸附法（ELISA）

酶聯免疫吸附測定法（ELISA） 是基于20世紀70年代開發的免疫學和細胞工程學的微觀檢測技術。其原理是抗體吸附在固相載體上以形成酶反應板的孔。然后將酶標記的抗原和樣品混合物加入酶反應板的孔中，引起特定的免疫反應以形成具有酶標記的抗原-抗體復合物。最后，將這種酶的底物加入小孔中進行顯色反應。比較顯色反應完成后樣品出現的顏色與標準品的顏色的深淺，從而判斷出樣品中待測物（即黃曲霉毒素）的含量[10]。ELISA及其試劑盒可用于定性和定量的檢測。Liu D等人[11]用ELISA檢測試劑盒檢測了生牛奶中黃曲霉毒素的含量并對試劑盒的原理與檢測結果進行了更完整的描述和說明。該方法靈敏度高、費時短、特異性較強、不用接觸有毒樣品，最低檢出限為0.02μg/kg[12]。不過也有缺點，此方法所用的酶容易受外界條件的影響，外界條件的改變可能會使檢測的結果不準確，而且如果對樣品的前處理不適當，容易出現假陽性或陰性結果，同時ELISA試劑也需要低溫保藏否則會影響檢測結果。

5.3.2 放射免疫分析法（RIA）

放射免疫分析法與酶聯免疫吸附法的原理基本相同，不同的是RIA所用的標記物為放射性元素而ELISA所用的標記物是酶。放射免疫分析法的檢測結果具有高度特異性和靈敏性、儀器檢測快速精確、操作簡便且易于標準化。但由于其標記物是放射性元素，所以長時間使用此方法檢測會對接觸到放射性元素的人們身體健康造成極大危害，目前這種方法也逐漸被其他更好的方法所替代，不再廣泛應用。5.3.3 膠體金免疫層析法

膠體金免疫層析技術（Immune colloidal gold technique）是基于抗原和抗體特異性結合的一種快速檢測的固相膜免疫分析技術。其原理是樣品中游離的抗原與金標抗體結合。如果樣品中沒有待測抗原，則游離金標抗體將與固定在膜上的半抗原特異性結合形成紅色帶，測試結果為陰性；如果含有待測抗原，則游離抗原與金標抗體結合，其可抑制固定在膜上的半抗原與金標抗體的結合。隨著樣品中待測抗原含量的升高，所形成的紅色條帶變淺，樣品中待測抗原的含量與條帶顏色的深淺成反比，檢測結果呈陽性。由于該方法操作簡便、所需檢測時間短、靈敏度高，所以常應用于大批量樣品的快速現場檢測和實驗室樣品的初步篩選，具有可觀的發展前景。目前，已經研發出了一種用于快速定量檢測黃曲霉毒素的膠體金檢測試劑盒。宋青龍等人[13]用膠體金快速檢測試劑盒檢測了玉米中黃曲霉毒素的含量，并分析了試劑盒檢測方法，利用試劑盒檢測不同濃度的霉菌毒素標準品，根據結果的特異性發現了每種檢測到的毒素含量均小于2μg/kg，證明了檢測黃曲霉毒素的試劑盒與玉米赤霉烯酮、伏馬毒素、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（嘔吐毒素）等均不出現交叉反應。

5.3.4 金標免疫層析法（GICA）

金標免疫層析技術（Gold labeled immunochromatographic assay，GICA） 也被人們稱為金標試紙法，它是基于膠體金免疫層析技術開發的單克隆抗體設計的固相免疫分析方法。使用納米金作為標記物可以在短時間內測定樣品中的AFT含量，并且可以得到直觀、準確的結果。該方法不需要分離結合標記物與自由標記物，從而省去了許多繁瑣的預處理步驟。趙曉聯等人[14]對此方法進行了一定的分析，利用不同質量濃度的黃曲霉毒素的標液測定出金標試紙的最低檢出限為2.5 ng/mL，并指出金標試紙在37℃條件下可保存7 d，4℃條件下可保存10個月左右。結果的重復性好，AFB1單克隆抗體與AFB2，AFG2交叉反應率分別為7.14%和6.25%，交叉率較低。金標試紙法的靈敏度高，不需要儀器設備之間復雜的相互配合，檢測亦可隨時隨地進行。孫秀蘭等人[15]提出鹽、重金屬離子和油脂對金標試紙檢測影響較大，其中重金屬的影響程度為Fe3+＞Cu2+＞Pb2+＞As3+，而對于一些含鹽較高的物質為了使測定結果更加準確，一般在檢測前先進行脫鹽處理。該方法定性檢測黃曲霉毒素的準確度超過85%，靈敏度為4 ng/mL。此外，樣品中黃曲霉毒素的檢出限可達到20 ng/g[16]。當下，隨著檢測技術的不斷發展進步，金標試紙法漸漸被人們接受并廣泛應用。

5.3.5 免疫親和柱-熒光分光光度法

熒光分光光度法原理是以免疫親和柱作為分離手段，將樣品通入免疫親和柱，樣品中的AFT可在免疫親和柱的作用下進行凈化、富集。免疫親和柱將高選擇性地選擇吸附樣品中的AFT并讓其他雜質通過，然后用極性有機溶劑洗脫下來被吸附的AFT，即可進行定量檢測。將洗脫的凈化液與碘液或溴水進行反應，使AFB1和AFG1衍生成具有高熒光活性的穩定的物質，然后利用熒光光度計，在一定條件下即可測出樣品中AFT含量。這樣檢測出的結果精密度較高，平均回收率較好，但其所用到的儀器價格都比較昂貴、操作有些繁瑣，所以在實驗室中不經常使用此方法。

5.4 生物傳感器

生物傳感器是基于生物技術和電子技術的復雜儀器，使用生物組件作為傳感器的主要功能元件。包括4個部分：即生物識別元件、轉換元件、機械元件和電氣元件組成。檢測的原理是使待測樣品中的抗原（即黃曲霉毒素） 與由抗體（或抗原） 與轉換器構成的傳感器上的生物識別元件的特異性抗體反應，以形成抗原抗體的特異性結合物，結合物的量的多少可由轉換器轉換成不同強度的電信號，根據電信號的強弱變化，可檢測出樣品中黃曲霉毒素的含量。林海等人[17]進行了一系列研究后提出這種生物傳感器的專一性較強，只能與特定的底物發生化學反應后傳出信號，不會受到樣品內在因素的干擾（如樣品的顏色、濁度等），分析速度快、精度高，誤差可減小到1%。王亞楠等人[18]提出生物傳感器檢測AFT的LOD為0.25μg/kg，范圍為0.25～4.0μg/kg。目前，生物傳感器測定AFT的方法還不夠成熟，難以實現大批量的檢測，需要進一步的完善。

6 黃曲霉毒素的預防與控制

黃曲霉毒素具有很強的熱穩定性，巴氏消毒也不能徹底殺滅黃曲霉毒素。Cui X等人[19]通過試驗驗證了這一結論，測出AFT在雞（動物）體內主要沉積在肝臟與腎臟，在食用前加熱也不易去除，并且指出沉積在動物體內的這些毒素會隨食物鏈進入人體內，人類通過長時間的攝入即可引起慢性毒性，對人們的健康會造成損害。

一般的安全防控措施包括：將花生、大豆、稻谷、小麥等在貯藏前應迅速降至其水分含量達8%～13%或以下，并貯藏于干燥的地方（相對濕度75%以及室溫10℃以下）；貯藏期間注意通風防潮；降低食物表面環境的氧氣濃度；加強糧食，大豆等糧油農產品的貯藏和銷售和售前檢驗；化學方法防霉，加入一些防霉劑（如溴甲烷，二氯乙烷）；豆類、谷類應洗凈后烹煮；挑選出霉變的糧食顆粒（加堿淘洗再搓洗）；適當的添加一些堿性物質，或者用紫外光照射進行去毒。

7 結語

黃曲霉素會對人體健康造成非常嚴重的危害。因此，黃曲霉毒素的檢測方法和限量必須得到更多關注和發展，中國還應制定更為嚴格的黃曲霉毒素標準。

隨著現代科學技術的不斷進步，特別是在免疫學、分子生物學和生物化學方面的不斷發展，已經研發建立起了許多既快速又簡便，同時特異性強、靈敏度高的檢測方法。但是，現有的AFT檢測方法有利有弊，所以在測定AFT含量時可結合多種方法進行測定，得出最為準確明了的數據。