片狀載體固定化胰蛋白酶的研究

黃冬麗，何云富，何亞濤，丁功濤

（西北民族大學生命科學與工程學院，甘肅蘭州 730124）

0 引言

固定化酶技術近年來廣泛應用于醫藥、食品加工等領域，由于其具有利用率高、酶活性好、節約資源等優勢，因此成為研究的熱點。胰蛋白酶來源于動物的胰臟，一般用于消化細胞間的軟組織。當其水解蛋白質時，作用于與賴氨酸或精氨酸相連接的肽鍵，細胞間黏蛋白和糖蛋白被除去，影響細胞骨架，使細胞分離[1]，在醫藥、食品工業等領域有著廣泛的應用[2]。由于胰蛋白酶在水溶液中會發生自身消化反應，存在利用率不高、無法回收利用、工業生產上成本高等問題，因此常采用固定化技術對胰蛋白酶進行固定化，提高了胰蛋白酶的利用率[3]。

戊二醛作為片狀載體與胰蛋白酶固定化反應體系中的交聯劑，具有2個反應性活性醛基，可與胰蛋白酶分子中的氨基酸殘基和片狀載體上暴露的活性位點發生反應，產生穩定的交聯橋，從而在反應中達到胰蛋白酶固定化的目的。片狀載體是由高分子材料聚丙烯合成的紙片狀載體，用于動物細胞貼壁生長，半懸浮培養的載體，其內部含有網格結構，也便于在戊二醛處理后與胰蛋白酶發生交聯。張黎明等人[4]采用殼聚糖固定化胰蛋白酶，提高了胰蛋白酶的利用率，但固定化載體難回收。與傳統的固定化材料相比，片狀載體不僅提高了酶的利用率，還具有易回收的優點[5]，在生產中可以節約成本。由于其突出的優勢，因此在今后的實際生產中具有更加廣泛的應用前景。試驗主要對胰蛋白酶的固定化時間、固定化溫度、固定化pH值和固定化胰蛋白酶質量分數進行初步探討，并對固定化效果進行評估，希望為以后的研究奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

胰蛋白酶、片狀載體，民海生物有限公司提供；氫氧化鈉、無水乙醇、體積分數為38%的鹽酸溶液、體積分數為20%的戊二醛溶液、硫酸銨，煙臺市雙雙化工有限公司提供；氫氧化鈉、無水乙醇、硫酸銨，均為分析純。

1.2 主要儀器

Biomate 5型紫外可見分光光度計，上海智成有限公司產品；ISS-4075型立式水平搖床，上海沉匯儀器有限公司產品；MT90型磁力攪拌器，溫州邁騰機械科技有限公司產品；MP120-BLE型便攜式酸度計，梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 固定化活性載體的預處理

準確稱取試驗組片狀載體5.00 g，先分別加入到磨砂口三角瓶中，再加入小號磁性轉子，最后加入20 mL 70%乙醇，20 mL 0.5 mol/L的硫酸銨溶液，20 mL 4%HCl溶液，20 mL 4%NaOH溶液，加蓋，置于溫度15℃的磁力攪拌器中，設置轉速100 r/min，時間30 min，啟動攪拌器，待結束后將載體用蒸餾水水洗至中性，取出磁性轉子。

1.3.2 胰蛋白酶的固定化

紫外分光光度計測定不同濃度胰蛋白酶溶液的吸光度，設置吸收波長為280 nm，吸光度為0.2～0.8，繪制標準曲線，得到方程，R2≥0.9判定為可信。

稱取經預處理的片狀載體，分別加入質量分數為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%的胰蛋白酶溶液，0.3%的戊二醛溶液，加蓋，置于水平搖床上，設置轉速、時間、溫度、pH值，結束后取出載體，將濾液轉移到試管中，并放在4℃冰箱中靜置1 h，取上清液測吸光度[6]，以吸光度計算固定化載量。

1.3.3 酶活力的測定

測定胰蛋白酶活力可以采用Folin法[7]。具體方法如下：加入2%的卵清白質作為底物，然后加入一定量的胰蛋白酶液，在溫度35℃，pH值8的條件下恒溫振蕩10 min，終止反應后抽取濾液用Folin試劑顯色，于波長680 nm處測定吸光度。

2 結果與分析

2.1 交聯劑濃度對固定化酶載量及活力回收率的影響

不同質量分數戊二醛對固定化酶活力回收率的影響見圖1。

圖1 不同質量分數戊二醛對固定化酶活力回收率的影響

由圖1可知，酶活力回收率隨戊二醛質量分數的增加而逐漸下降。在質量分數達到0.3%之前，酶活力回收率隨戊二醛質量分數的增加下降的較慢；當質量分數達到0.3%之后，由于戊二醛質量分數過高，抑制了酶的活性，導致酶活力下降，故在戊二醛質量分數達到0.3%之后，酶活力回收率下降明顯[8]。

不同質量分數的戊二醛對酶固定化載量的影響見表1。

由表1可知，酶的固定化載量隨戊二醛質量分數的升高而增加。在戊二醛質量分數達到0.3%之前，酶的固定化載量隨戊二醛質量分數的升高增加明顯，當質量分數達到0.3%以后，酶的固定化載量基本不再增加。

結果表明，0.3%戊二醛和0.4%戊二醛作為交聯劑對固定化載量影響差異不顯著，對固定化酶活力回收率影響差異顯著。在研究中可以確定固定化反應體系中最佳戊二醛質量分數為0.3%。

表1 不同質量分數的戊二醛對酶固定化載量的影響

2.2 胰蛋白酶質量分數對固定化率的影響

在固定化溫度35℃，固定化pH值8.0，固定化時間3 h，取相同量的載體5.00 g，只改變胰蛋白酶質量分數為1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%，分別制備固定化胰蛋白酶。

不同質量分數胰蛋白酶對固定化率的影響見圖2。

圖2 不同質量分數胰蛋白酶對固定化率的影響

由圖2可知，在胰蛋白酶質量分數達到2.0%時，此時酶的固定化率最高。相同質量的片狀載體加入不同質量分數的胰蛋白酶，固定化率隨著胰蛋白酶質量分數的升高而增加。由于片狀載體可固定的胰蛋白酶的酶量是有限的，在胰蛋白酶質量分數增加到一定量之后，片狀載體對胰蛋白酶的固定化量已接近飽和，固定化率達到最高；此后，再增加酶質量分數，固定化率基本不再變化[9]。結果表明，胰蛋白酶在質量分數達到2%時固定化率最高，在研究中可以確定反應體系中胰蛋白酶質量分數達到2%時固定化效果最好。

2.3 不同固定化時間對固定化率的影響

在固定化溫度35℃，固定化pH值8.0，胰蛋白酶質量分數2%，取相同量的載體5.00 g，只改變固定化時間為0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 h，分別制備固定化胰蛋白酶。

不同固定化時間對固定化率的影響見圖3。

圖3 不同固定化時間對固定化率的影響

由圖3可知，在固定化時間為1.5 h時，酶的固定化率最高。片狀載體內部有網格狀結構，具有較大的比表面積。在反應的開始階段，胰蛋白酶的固定化速率較快，故固定化率隨著固定化時間的增加而升高較快；隨著固定化時間增加到1.0～1.5 h，固定化量逐漸達到飽和，此時固定化率的增長速度放緩；在固定化達到1.5h后，片狀載體對胰蛋白質量分數的固定化量已經達到飽和，此后再增加固定化時間，對酶的固定化率影響不大[10]。結果表明，固定化時間達到1.5 h時固定化率最高，在研究中可以確定反應體系中固定化時間達到1.5 h時固定化效果最好。

2.4 不同固定化溫度對固定化率的影響

在固定化pH值8.0，胰蛋白酶質量分數2%，固定化時間3 h，取相同量的載體5.00 g，只改變固定化溫度25，30，35，40，45，50℃，分別制備固定化胰蛋白酶。

不同固定化溫度對固定化率的影響見圖4。

圖4 不同固定化溫度對固定化率的影響

由圖4可知，在固定化溫度達到40℃時，固定化率最高。溫度對固定化率的影響主要通過影響酶的活力來調節。當固定化溫度較低時，酶的活力受到抑制，此時酶的固定化率較低；隨著固定化溫度的上升，酶的活力增加，故酶的固定化率升高；在達到酶的最適溫度時，酶的固定化率最高；此后再升高固定化溫度，反而會抑制酶的活性，導致酶的固定化率下降[11]。結果表明，固定化溫度達到40℃時固定化率最高，在研究中可以確定反應體系中固定化溫度達到40℃時固定化效果最好。

2.5 不同固定化pH值對固定化率的影響

在固定化溫度35℃，胰蛋白酶質量分數2%，固定化時間3 h，取相同量的載體5.00 g，只改變固定化pH值6.5，7.0，7.5，8.0，8.5，9.0，分別制備固定化胰蛋白酶。

固定化pH值對固定化率的影響見圖5。

圖5 固定化pH值對固定化率的影響

由圖5可知，在固定化pH值達到8.0時，固定化率最高。固定化pH值對固定化率的影響主要通過影響酶的活力來調節。當固定化pH值較低時，酶的活力受到抑制，此時酶的固定化率較低；隨著固定化pH值的上升，酶的活力增加，故酶的固定化率升高；在達到酶作用的最適pH值時，酶的固定化率最高；此后pH值再增加，反而會抑制酶的活性，導致酶的固定化率下降[12]。結果表明，固定化pH值達到8時固定化率最高，在研究中可以確定反應體系中固定化pH值達到8.0時固定化效果最好。

3 結論

固定化溫度，固定化pH值，固定化時間和胰蛋白酶質量分數都是影響胰蛋白酶固定化率的重要因素，通過控制這些固定化條件，同時選用合適的固定化載體，在溫和的反應條件下，可成功地制備性能優良的固定化胰蛋白酶。

目前常采用的固定化材料有纖維素球、殼聚糖和磁納米材料，然而，試驗所選用的固定化材料為片狀載體。與傳統的固定化材料相比，片狀載體具有成本低、操作簡單、易回收、固定化率高等優點。

同時固定化酶也解決了游離酶穩定性低、易降解、難回收的缺點，為生產簡化了操作，節約了成本，也為以后關于固定化酶的研究提供了參考。