肝內膽管癌中Wip1和MMP-2表達關系及臨床意義

張 良 周進學 肖 騰 向宏市

肝內膽管細胞癌(intrahepatic cholangiocarcinoma，ICC)是起源于二級膽管及其分支上皮的惡性腫瘤[1]。ICC腫瘤無包膜、邊緣不清，生物學行為特殊，可沿膽管壁周圍或者縱行浸潤性生長，侵襲及轉移能力極強[2]。近年來，我國ICC發病率呈明顯上升趨勢，嚴重危害了我國居民的身體健康及生命安全[3]。根治手術是目前治療ICC的一線治療方案，但大多數患者確診時已為晚期，不適合進行手術治療[4]。本研究旨在探討ICC中野生型p53誘導的蛋白磷酸酶1(Wild type p53 induced protein phosphatases，Wip1)[5]、基質金屬蛋白酶-2(Matrix metalloproteinase 2，MMP-2)表達水平及臨床意義，試圖為臨床治療ICC提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

選取2015年7月至2016年7月鄭州頤和醫院及河南省腫瘤醫院收治的38例ICC患者肝內膽管癌組織標本為研究對象。所有患者臨床資料齊全，且術前均未接受任何放化療及激素治療，未合并其他惡性腫瘤，其中男性21例，女性17例；患者年齡28～77歲，平均年齡(54.28±6.43)歲；高分化7例，中分化18例，低分化13例；伴淋巴結轉移者19例，無淋巴結轉移者19例；肝炎病毒攜帶者10例(乙肝9例，丙肝1例)；TNM分期Ⅰ～Ⅱ期14例，Ⅲ～Ⅳ期24例。

同期選取36例與我院行手術切除術的膽管結石及膽道損傷者正常膽管組織標本為對照，其中膽管結石27例，膽道損傷者9例，患者年齡25～69歲，平均年齡(55.26±5.54)歲。2組患者性別、年齡等一般資料比較，差異無統計學意義(P>0.05)。

本研究經本院倫理委員會批準進行，且患者及家屬了解本研究，并同意簽署知情同意書。

1.2 主要試劑

免疫組織化學(Streptavidin-perosidase，S-P)試劑盒、DAB顯色試劑盒，購自于北京中杉金橋技術公司；鼠抗人Wip1單克隆抗體，鼠抗人MMP-2單克隆抗體，購自于武漢博士德生物有限公司。

1.3 方法

膽管組織標本離體后立即放入液氮罐中速凍，于-80 ℃冰箱妥善保存備用。所取標本經10%甲醛固定，石蠟包埋，制作厚度為4 μm的石蠟切片；采用S-P方法，DAB顯色，利用S-P試劑盒檢測石蠟切片中Wip1、MMP-2蛋白表達，以已知陽性切片為陽性對照，PBS液代替一抗為陰性對照，按照試劑盒使用說明書嚴格進行。

1.4 結果判定

Wip1、MMP-2均為細胞質、細胞膜表達，以胞質/胞膜染色呈現棕黃色者為陽性表達。400×高倍鏡下觀察，染色強度評分：無色0分、淺黃色1分、棕黃色2分、棕褐色3分，陽性細胞數所占比例：0為0分、0～25%為1分、>25%～75%為2分、>75%為3分。以細胞染色強度與陽性細胞所占百分比評分乘積進行統計分析。

1.5 統計學分析

利用統計學軟件SPSS 19.1進行數據統計分析，計數資料采用卡方檢驗，相關性分析采用Spearman秩相關檢驗，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 2組之間Wip1、MMP-2蛋白表達水平比較

ICC組織中Wip1蛋白陽性表達率為78.95%(30/38)，明顯高于正常膽管組織中Wip1蛋白陽性表達率8.33%(3/36)，差異有統計學意義(χ2=37.308，P<0.05)，ICC組織中MMP-2蛋白陽性表達率為73.68%(28/38)，明顯高于正常膽管組織中MMP-2蛋白陽性表達率5.56%(2/36)(χ2=35.596，P<0.05)。

2.2 Wip1、MMP-2蛋白表達與ICC臨床病理特征之間的關系

Wip1蛋白表達與ICC患者年齡、性別、臨床分期、有無肝炎、組織學分級無明顯相關性(P>0.05)，與患者門靜脈浸潤、淋巴結轉移密切相關(P<0.05)；MMP-2蛋白與ICC患者年齡、性別、有無肝炎、組織學分級無明顯相關性(P>0.05)，與患者臨床分期、門靜脈浸潤、淋巴結轉移密切相關(P<0.05)。見表1。

表1 Wip1、MMP-2蛋白表達與ICC臨床病理特征之間的關系/例

2.3 ICC組織中Wip1、MMP-2蛋白表達相關性分析

采用卡方檢驗與Spearman法進行相關性分析，Wip1與MMP-2在ICC組織中表達呈較強正相關(γs=0.683，P<0.05)。

3 討論

ICC是臨床上發病率僅次于肝癌的一種肝臟原發性惡性腫瘤，近年來發病率有明顯上升趨勢[6]。ICC解剖定位于肝內，早期即可出現周邊衛星灶或者淋巴結轉移，侵襲及轉移能力極強。肝葉切除是目前唯一可能治愈ICC的方法[7]，但因ICC病情進展較快，臨床常無法有效把握ICC患者手術時機，預后效果較肝癌更差。探究ICC發病機制，尋找新的特異性腫瘤標記物，或許可為ICC早期診斷及治療提供新思路。

Wip1基因是由PPM1D基因編碼，屬絲氨酸/蘇氨酸蛋白磷酸酶PP2C家族中成員之一[8]，位于人類染色體17q23或q24區域。國外學者在野生型小鼠胚胎成纖維細胞轉化過程中發現，Wip1基因與原癌基因Myc、Ras及Neul等具有明顯協同作用，Wip1基因被證實是一種新型的原癌基因[9]。隨后大量研究證實[10]，Wip1基因在卵巢癌、胃癌、乳腺癌等多種腫瘤中明顯高表達，且其高表達與腫瘤患者預后存在密切關系?，F已發現Wip1基因可直接或者間接作用于包括p53、ATM、p38MAPK、chk1、chk2、UNG2、MDm2在內至少7種靶蛋白去磷酸化，從而降低p53轉錄活性來發揮致癌作用。目前，國內有關Wip1基因在惡性腫瘤中表達研究相對較少。MMPs是機體一種重要的蛋白水解酶[11]，廣泛參與機體胚胎形成、創傷愈合、血管反應等生理反應，以及關節炎、動脈粥樣硬化、病毒感染、癌癥轉移等病理過程。研究表明[12]，MMPs不僅具有有效的清除細胞外基質的作用，還能夠通過參與血管生長因子的形成，起到促進腫瘤血管新生，協助腫瘤細胞發生免疫逃逸，廣泛參與機體內腫瘤侵襲及轉移過程。MMP-2是MMPs家族重要成員之一，其能夠有效分解基膜主要成分，MMP-2在惡性腫瘤中過度表達可導致癌細胞發生侵襲及轉移能力的增強。研究表明[13-15]，MMP-2在胃癌、乳腺癌、骨肉瘤、膠質瘤等多種腫瘤中呈明顯高表達，參與腫瘤發生及發展。因此，本研究以Wip1、MMP-2為研究靶點，探討二者在ICC組織中表達水平及其與ICC臨床病理特征之間的關系，試圖為早期診斷及治療ICC提供新的靶點。

本研究結果表明，ICC組織中Wip1蛋白陽性表達率為78.95%，明顯高于正常膽管組織中Wip1蛋白陽性表達率8.33%；ICC組織中MMP-2蛋白陽性表達率為73.68%，明顯高于正常膽管組織中MMP-2蛋白陽性表達率5.56%；可見正常組織中Wip1、MMP-2陽性表達均較低，Wip1、MMP-2在ICC組織中明顯上調表達，提示Wip1、MMP-2上調表達參與ICC疾病發生。進一步探究二者與ICC臨床病理特征之間的關系可見，Wip1、MMP-2蛋白表達與ICC患者年齡、性別、有無肝炎、組織學分級無明顯相關性，與患者門靜脈浸潤、淋巴結轉移密切相關，有門靜脈浸潤及淋巴結轉移者Wip1、MMP-2蛋白陽性表達率明顯高于無門靜脈浸潤及淋巴結轉移者，其中MMP-2蛋白表達還與患者臨床分期關系密切，TNM分期Ⅲ～Ⅳ期患者MMP-2蛋白陽性表達率明顯高于Ⅰ～Ⅱ期者，提示二者與ICC疾病發生及發展密切相關，二者高表達與ICC侵襲及轉移顯著相關，推測Wip1、MMP-2可作為臨床早期診斷及治療ICC的潛在生物學靶點，對于臨床診治ICC具有一定指導意義。相關性分析結果可見，Wip1與MMP-2在ICC組織中表達呈較強正相關，說明Wip1與MMP-2在ICC中異常表達具有協同作用，二者協同促進ICC腫瘤的侵襲及轉移，其具體作用機制，值得進一步深入探究。

綜上所述，本研究結果表明，Wip1、MMP-2在ICC中明顯高表達，二者參與肝內膽管癌發生及發展過程，二者與ICC門靜脈浸潤、淋巴結轉移密切相關。本文首次提出Wip1與MMP-2在ICC中異常表達存在協同作用，后續將對其具體作用機制進行進一步的探討。