乳鐵蛋白促進骨健康作用的研究進展

張基亮，張蘭威,2，馬鶯，韓雪

(1.哈爾濱工業大學化學與化工學院，哈爾濱150090;2.中國海洋大學食品科學與工程學院，山東青島266003)

0 引言

乳鐵蛋白（Lactoferrin，LF）是1939年由Sorensen等人分離得到的“紅色蛋白”。該蛋白是一種非血紅素轉鐵蛋白，由人、牛、羊和馬等的上皮細胞合成多存在于乳、淚等分泌物中，與血清轉鐵蛋白、卵轉鐵蛋白和黑素轉鐵蛋白共同組成了轉鐵蛋白家族[1]。LF是一種多功能性的糖蛋白，分子量大約為80 ku，具有促進骨生長、抗微生物、抗炎、抗癌、免疫調節和酶活性等功能[2]。為了確定LF是否能被完整的吸收利用，Hutchens等用[13C]標記富含亮氨酸、[15N2]或[2H4]標記富含賴氨酸的人源LF（human lactoferrin，hLF），以48 h為周期喂養早產兒，收集每個早產兒96 h的尿液，通過親和色譜、高效反向色譜和質譜檢測的方法對尿液中的LF及其片段進行分析。結果表明，完整的LF是通過腸道吸收并且排泄到尿液中，并且幾乎所有尿液中LF都來源于母乳，證明了食源性LF可通過嬰兒腸細胞轉運并進入系統循環加以利用的[3]。近年來，食源性乳鐵蛋白促進骨健康作用得到了研究者的廣泛關注[4-5]。針對于此本文闡述了LF促進成骨細胞增殖、分化和生存，以其機制的研究進展。

骨質疏松被定義為骨密度的降低和骨微觀結構的改變，骨微觀結構的改變增加了骨折敏感性。骨流失是由成骨細胞和破骨細胞活性失衡的結果，成骨細胞的生存有助于保證成骨細胞和破骨細胞的比例，維持成骨細胞發揮較高的活性，從而對骨健康起到有益的作用。LF在體內有效地促進骨區域性增加的機制可能是LF促進成骨細胞有絲分裂作用和抑制破骨細胞形成作用結合所致的，LF對于骨的作用實際上是使骨的總體積增加，表明LF是成骨細胞的生存因子，同時也是骨調節的效應物[6]。

1 乳鐵蛋白抑制成骨細胞凋亡機制

Andrew Grey等研究發現，但用LF的生理濃度（1～10 ug/mL）作用細胞時，可以在血清用盡時有效地抑制鼠前體成骨細胞和骨肉瘤細胞的凋亡，并且認為LF抑制成骨細胞的凋亡是促使成骨細胞增多的一個有效途徑[7]；Jillian Cornish通過轉移酶介導的三磷酸脫氧鳥苷-生物素刻痕末端標記（TUNEL）試驗中陽性細胞數量來確定細胞的凋亡情況，發現當LF的濃度為10μg/mL時，其抑制成骨細胞的凋亡率高達50%

～70%[4]

。

LF進入細胞是通過低密度脂蛋白受體相關蛋白1（LRP1）的內吞作用實現的，LRP1具有調節細胞內信號的能力，可以使酪氨酸和絲氨酸磷酸化。普遍認為，磷脂酰激醇3-激酶（PI3K）依賴性蛋白激酶（Akt）磷酸化的激活是使生長因子促進細胞生存的機制。研究表明，在鼠初級成骨細胞培養時添加LF導致Akt的快速磷酸化，且Akt磷酸化程度與LF呈劑量關系，Akt可以被特殊的PI3K抑制劑LY294002所抑制[8]。成纖維細胞中表達的天然LRP1與非成纖維細胞的LRP1相比中，LF不能選擇性地阻止細胞凋亡，但在成骨細胞中LF激活PI3激酶依賴激酶的信號，使成骨細胞增殖。用LRP1的抑制劑受體相關蛋白（RAP）共同處理不能抑制LF誘導的Akt磷酸化，沒有影響LF促進細胞生存的能力，表明LF的作用獨立于LRP1的作用之外[9]。Andrew Grey等將LRP1/2抑制劑以等量或高于其抑制LF誘導成骨細胞或成纖維細胞增殖的量添加到細胞培養基中，結果沒有影響LF誘導細胞生存，后又通過凋亡細胞標記的方法以光譜分析從細胞培養中釋放的染料，證明LF抗凋亡活性不需要LRP1[7]。即LF提高細胞生存的分子機制有別于基本的有絲分裂作用，通過不依賴于細胞膜的受體來調節的[10]。

蛋白酶3（caspase 3）活性，是細胞凋亡的標志。Ashley A.Amini等用重組人乳鐵蛋白（rhLF）處理成骨細胞系MC3T 3-E1時，以抗凋亡因子作為陽性對照用于caspase3實驗，rhLF處理組的caspase3活性要明顯低于溶媒組的caspase3活性，表明rhLF可以通過調節caspase 3的活性來發揮其抑制細胞凋亡的能力。另外，LF還有提高一些具有阻止由血清缺少引起的細胞凋亡的細胞外因子（Wnt）的表達，如Wnt3和Wnt5。調節Wnt5的抗凋亡作用信號途徑是蛋白激酶A（PKA）/cAMP相應結合蛋白（CREB）。實驗表明當用rhLF處理細胞24 h后，在細胞外因子家族中的Wnt5上升了3.8倍[11]。

2 乳鐵蛋白促進成骨細胞增殖和分化

有絲分裂是維持個體正常生長和發育所必須的，對于骨細胞來說適當地促進成骨細胞的有絲分裂可以促進骨的健康。體外研究發現，LF可以刺激成骨細胞的增殖和分化，Jillian Cornish等用濃度為1-100 μg/mL的LF培養小鼠成骨樣細胞，以胸苷插入的增加量來衡量細胞的增殖，結果發現成骨細胞的增殖和分化都與LF成劑量關系，當LF的濃度達到10μg/mL時，胸苷插入數量是對照組的兩倍。成骨細胞分化的作用包括骨基質沉淀和礦化兩方面，當培養鼠成骨細胞3周時，骨結節形成數量的增多和礦化骨形成區域增加也同樣是與LF劑量相關的。只有當LF的濃度達到100μg/mL或者更高時，其促進成骨細胞分化作用才有顯著的效果，表明刺激成骨細胞分化所需LF的濃度是刺激成骨細胞增殖所需的10倍。體內實驗中，分別將LF、白蛋白和溶媒在成年雄性鼠頭骨連續注射5天，結果發現只有LF可以使鼠頭骨礦化率和骨形成呈區域性增加，且形成的新骨與LF劑量相關[4]。Takayama等研究表明，LF可以提高人類成骨細胞系MG63堿性磷酸酶活性以及骨鈣素的量[12]。當將LF注射在鼠顱骨時，發現在未注射LF的顱內側和對側都有骨增加，LF這種促進骨生長的作用是其他一些具有促進骨生長如降鈣素、甲狀旁腺素和腎上腺髓質素所沒有的，LF能在其注射位置很遠的地方促進新骨的形成，進一步證實LF有效地增加骨生長。

基因表達差異研究表明，LF在調節成骨細胞有絲分裂活性方面可能的作用是激活一些因子，其可能的生理學功能是在骨生長和康復方面是一個正調節因子[4]。LF具有誘導成骨細胞合成生長因子、細胞因子和趨化因子的能力。其中包括血管內皮生長因子（VEGF）、胰島素樣生長因子（IGF），成纖維細胞生長因子（FGF）和白細胞介素-6（IL-6）等[13]。牛乳鐵蛋白（bovine lactoferrin，bLF）增加小鼠成骨細胞MC3T3-E1和小鼠初級成骨細胞VEGF和FGF-2的mRNA表達以及這兩種蛋白在細胞內的水平；體內外試驗證明，IGF-1作為內分泌和旁分泌調節骨代謝，尤其是在富含IGF-1的頭骨組織中[14]。在體外，IGF作為合成代謝物刺激細胞增殖，加強成骨細胞分化作用，提高骨基質合成并且阻止細胞凋亡。在IGF-1缺失的細胞中，細胞增殖和堿性磷酸酶活性都急劇下降，在敲除IGF-1或者其受體的鼠模型中骨形成的下降是非常明顯，表明IGF-1表達的減少強烈地降低成骨細胞的增殖和分化[15]。另外，缺失IGF-1表達的細胞幾乎停止了有絲分裂，使得LF促進成骨細胞分化作用消失。在正常細胞培養時，bLF的添加使得IGF-1mRNA表達水平升高，10μg/mL的bLF顯著的提高其mRNA的表達，當LF濃度達到100μg/mL時，mRNA的表達量為最高，并且bLF的添加還可以使IGF-1R的mRNA水平升高[16]；此外，LF還可以刺激IGF-1的翻譯，從而間接的促進成骨細胞的增殖和分化[17]。

3 促進骨健康的免疫調節機制

成骨細胞和前體破骨細胞既可以由同一種細胞受不同活化因子的影響而產生，也可以由不同細胞受不同活化因子的影響而產生。如圖1所示，核因子κB受體活化因子配體（RANKL）可以誘導T細胞、成骨細胞、骨細胞和滑膜成纖維細胞形成前體破骨細胞；白細胞介素-1（IL-1）和腫瘤壞死因子（TNF）可以誘導滑膜成纖維細胞和巨噬細胞形成前體破骨細胞。同時T細胞在受到白細胞介素-22（IL-22）的影響時可以轉化為成骨細胞。肝配蛋白B2可以使前體破骨細胞向成骨細胞轉化，因此活化因子的類型尤為重要。研究表明LF具有調節獲得性免疫的能力，特別是LF的攝入阻止免疫細胞在炎癥位點的補充和激活。LF可以降低RANKL和TNF等因子的表達，同時還可以提高IL-22的表達。表明LF可以通過調節活化因子的表達量來間接的促進骨健康[18]。

Jillian Cornish通過鼠骨髓培養評價LF對破骨細胞發展的作用，當用濃度為10μg/mL或更高濃度的LF處理細胞時，新形成的破骨細胞數量明顯地降低，當LF濃度達到100μg/mL時，破骨細胞形成完全停止。為確定LF可以作用于哪個階段破骨細胞，在試驗開始或者第二天將LF添加到細胞培養基中，結果發現這兩種形式的LF添加都可以降低破骨細胞形成，這就表明LF可以作用于前破骨細胞和成熟破骨細胞，但是LF對于分離出的成熟破骨細胞的骨吸收活性沒有影響。鑒于LF對于破骨細胞形成的抑制，通過成骨細胞和骨髓細胞RANKL和OPG的表達來研究LF的作用。LF的可以使成骨細胞OPG轉錄提高，降低RANKL的表達，當作用于骨髓細胞時，OPG mRNA水平在96 h時才有所上升，而RANKL mRNA水平在96 h有所下降，可以部分解釋抑制破骨細胞形成[4]。

圖1 骨免疫交聯調節成骨和破骨細胞的分化及活性

雌激素具有抑制目標T細胞產生TNF-α的能力，因此能夠阻止破骨細胞重吸收和預防骨流失。絕經期或卵巢切除都會使體內缺乏雌激素，進而使得骨白細胞數量增多，并且激活抗原呈遞細胞（APC）和T細胞。T細胞激活增加破骨細胞因子如NF-κB配體激活劑受體（RANKL）、提高嚙齒動物及人類破骨細胞的分化、成熟、激活和壽命并且使得免疫系統的前炎癥因子產生增多，TNF-α促進骨髓基質細胞產生RANKL，并誘導骨髓細胞中的前炎癥因子的分泌[19]

，結果導致微環境中刺激產生和釋放多種炎癥因子，這就使得破骨細胞骨吸收活性增強，導致骨質疏松的發生。研究發現，給予卵巢切除的大鼠LF后，可以降低一些溶骨因子如TNF-α和IL-1β的分泌，抑制炎癥因子對骨的分解作用，表明LF具有抑制破骨細胞的作用[4]。

Dorit Naot等用LF處理MC3T3-E1細胞，結果表明用LF處理2 h，IL-6的表達量達到最高值，22 h后又下降到基本水平。當用50μg/mL的 LF處理MC3T3-E1細胞2 h使得IL-6的mRNA增加了35倍，10μg/mL LF處理使其mRNA增加了5倍，表明IL-6的表達和LF呈劑量關系，并且可以快速地增加，呈現出瞬間的變化。同樣的方法處理鼠和人初級成骨細胞表現出同樣的效果。IL-11功能上與IL-6相關，都具有影響骨細胞增殖和分化的作用。使用實時PCR通過檢測經LF處理過的成骨樣細胞的cDNA的方法來衡量IL-11的表達量，IL-11在前體成骨細胞培養中可以快速增加，在鼠前體細胞中，LF處理2 h使得IL-11增加了6倍，在人前體細胞中LF處理8 h則使得IL-11增加了70倍。LF使得這些免疫因子的增加，間接的促進了成骨細胞的增殖和分化[20]。

4 抑制破骨細胞形成

破骨細胞是專門負責骨重吸收的細胞，破骨細胞高活性涉及到骨流失癥狀，如骨質疏松和溶骨癥。破骨細胞來源于單核巨噬細胞家族，特征是可以在細胞表面表達CD14。CD14是脂多糖受體，其主要生物學活性是作為脂多糖受體，識別、結合脂多糖或脂多糖復合物，介導細胞反應。CD14刺激細胞分泌TNF和IL-1等誘導破骨細胞形成的細胞因子，LF通過和脂多糖結合蛋白競爭來抑制脂多糖與CD14的相互作用[21]。體外研究發現，通過向培養鼠巨噬細胞系RAW264.7細胞的培養基中添加NF-κB受體活化因子配體（RANKL）可以誘導該細胞分化成破骨細胞。LF在抑制RANKL方面存在劑量關系，RANKL誘導破骨細胞生成不依賴于成骨細胞的存在[22]。另外，LF還可以降低兔破骨細胞和骨細胞混合培養時破骨細胞的骨吸收活性。與LF抑制破骨形成效果對比，LF不能影響分離獲得的成熟破骨細胞的骨吸收活性。雖然LF不影響完全分化的破骨細胞的骨吸收活性，但它通過降低新破骨細胞形成的數量來降低其骨吸收[23]。

Anne Blais[24]等人使用絕經后動物模型評價飲食中LF對骨代謝的作用時發現，LF對成骨細胞分化的增強是與破骨細胞分化的抑制相關聯。

5 乳鐵蛋白狀態對成骨作用的影響

5.1 不同鐵飽和度LF對成骨細胞增殖作用影響

不含鐵的（apo-）和鐵飽和（holo-）的LF對成骨細胞有絲分裂活性幾乎沒有影響，然而卻對成骨細胞增殖作用有著很大的不同。Wang等觀察到在體外LF刺激成骨細胞增殖活性隨鐵飽和度增加而降低，進一步動物實驗研究表明，對4周齡的ICRswiss雄性鼠連續5天每天在頭蓋骨皮下注射2次總劑量為4 mg/kg的LF，骨組織形態測定表明新骨形成趨向apo-LF比holo-LF效果好[25]。

Rulan Jiang等通過胸苷嘧啶插入試驗，同樣得出了apo-比holo-LF促進成骨細胞增殖效果好的結論，該研究使用針對乳鐵蛋白受體的功能阻斷性抗體抑制劑（U 0126）后，發現會導致apo-LF誘導細胞增殖受到抑制作用，而PI3K抑制劑明顯降低apo-和holo-LF誘導的增殖。盡管apo-和holo-LF都可以上調細胞周期素D1（ERK1/2和信號的效應物）的轉錄，只有apo-LF能夠開始ERK1/2信號途徑，而apo-和holo-LF都能激活PI3K激酶信號途徑。功能阻斷LFR和LFR siRNA抗體抑制apo-LF誘導ERK1/2信號途徑的激活，表明LFR是涉及到apo-LF誘導的ERK1/2的激活，但不能激活PI3K信號途徑，apo-和holo-LF存在著不同的途徑使細胞增殖[5]。不同鐵飽和度的LF之間的構象差異可能是引起他們之間對成骨細胞增殖活性不同的原因。通過熒光光譜和圓二色譜檢測發現當鐵飽和度增高時，使暴露的色氨酸增多、α-螺旋增加但β折疊下降[25]。

5.2 不同濃度和不同形式LF對成骨細胞增殖作用影響

HOU等人的研究發現，在用bLF處理成骨細胞室，bLF的濃度為10μg/mL時，能顯著地抑制成骨細胞的凋亡，然而，當bLF濃度為1 000μg/mL時，不僅沒有抑制細胞凋亡，反而會促進成骨細胞凋亡。這些結果表明bLF有效地抗凋亡作用，然而高濃度bLF對細胞有毒害作用[16]。

J.Cornish等人用重組N-糖苷酶F在室溫下過夜處理bLF，使其去糖基化，采用陽離子交換法收集去糖基化的bLF，通過去糖基化與未去糖基化bLF對鼠初級成骨細胞胸苷插入的方法來比較去糖基化bLF對成骨細胞增殖作用的影響，結果表明去糖基化的bLF比未去糖基化的bLF增殖作用顯著[26]。

5.3 不同環境和來源LF對成骨細胞增殖作用影響

LF與糖的相互作用可能降低或者破壞一些蛋白質的生物學活性，如免疫調節功能。葡萄糖的加入使得LF對成骨細胞增殖活性降低顯著。其原因可能是由于結合糖后使得LF的構象發生變化因而引起了其生物學功能變化[19]。重組人乳鐵蛋白與天然人乳鐵蛋白的序列一致，說明重組hLF與天然hLF具有相似或相同的生物活性。在人乳鐵蛋白轉基因小鼠中，進入體內的人乳鐵蛋白已被免疫系統所承認，而不被認為是侵入體內的抗原，而與天然乳鐵蛋白比較，重組人乳鐵蛋白在經過成人胃腸道后幾乎被完全降解，而天然牛乳鐵蛋白僅降解了40%左右。重組乳鐵蛋白糖鏈中含較高的甘露糖殘基，特別是真菌表達系統，使重組蛋白半衰期縮短，對比胰蛋白酶對hLF和bLF的降解表明，hLF的抗性大約是bLF的100倍。這種不同是由于糖基化位點的不同，在bLF中，Asn281的糖基化比Lys282糖基化能更有效地抵抗降解[27]。糖基化不同的LF之間對成骨細胞增殖、分化和抗凋亡作用也存在著差異。

6 小結

LF可以通過抑制成骨細胞凋亡、促進成骨細胞增殖和分化以及免疫調節的方式來促進成骨細胞量的增多，同時LF可以抑制破骨的形成，總體上使成骨細胞數量增多，破骨細胞數量減少，使二者比例增多，進而促進了骨的健康。研究乳鐵蛋白對成骨細胞增殖及破骨細胞抑制有利于對骨健康的了解，對今后預防及治療骨疾病提供了一個新的方向。