PCR技術(shù)結(jié)合試紙條法快速檢測乳粉中的克魯諾桿菌

姜霞，王蕊,潘瑞麗，孫露宏，李明雨，黨芳芳，趙玥明，曲艷艷，滿朝新，姜毓君b

(東北農(nóng)業(yè)大學(xué)a.食品學(xué)院,乳品科學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗室；b.國家乳業(yè)工程技術(shù)研究中心，哈爾濱150030)

0 引言

嬰幼兒配方奶粉為嬰幼兒提供了生長發(fā)育營養(yǎng)成分的同時，其安全性受到廣泛關(guān)注[1]。克魯諾桿菌（原阪崎腸桿菌）[2-3]，能夠引起新生兒腦膜炎，膿毒血癥等，致死率高達(dá)40%～80%[4]。而嬰幼兒配方奶粉作為克羅諾桿菌生長的天然培養(yǎng)基，是嬰幼兒患病的主要渠道[5-6]，因此快速檢測該菌具有重要意義。傳統(tǒng)的檢測方法耗時長，結(jié)果呈現(xiàn)慢[7-8]。而迅速發(fā)展的PCR法技術(shù)檢測時間相對短，靈敏度較高[9-11]。其結(jié)果通過電泳進(jìn)行分析，容易導(dǎo)致機(jī)體致癌致突變[12]，因此試紙條方法通過抗體的結(jié)合使用，特異性強(qiáng)[13]。目前針對克魯諾桿菌設(shè)計的PCR產(chǎn)物結(jié)合試紙條方法并未報道。本研究特異性識別PCR產(chǎn)物的方式來進(jìn)行克魯諾桿菌的特異性檢測，為食源性致病菌的快速檢測提供理論依據(jù)。

1 實(shí) 驗

1.1 材料

培養(yǎng)基及主要試劑：胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA），瓊脂粉，緩沖蛋白胨水(BPW)，2×Taq PCR MasterMix，瓊脂糖，細(xì)菌全基因組DNA提取試劑盒，嬰幼兒配方奶粉，膠體金。

儀器與設(shè)備：Bcn1360型生物超凈工作臺，TGC-16G型離心機(jī)，DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱，電熱恒溫水浴鍋，高壓蒸汽滅菌鍋，9700 PCR擴(kuò)增儀，DYY-10C型電泳儀，UVP凝膠成像系統(tǒng)，點(diǎn)膜儀，切割機(jī)。

1.2 方法

1.2.1 引物序列

針對ompA基因設(shè)計克羅諾桿菌的特異性引物，引物序列如下。

表1 PCR引物序列

1.2.2 菌種的培養(yǎng)和DNA的提取

選取阪崎克魯諾桿菌ATCC29544作為實(shí)驗菌株進(jìn)行相關(guān)實(shí)驗，菌株從保藏在-80℃冰箱中取出，按3%的接種量接種到TSB液體培養(yǎng)基中，活化培養(yǎng)12 h，之后進(jìn)行TSA固體培養(yǎng)基上進(jìn)行三區(qū)劃線，培養(yǎng)16 h,挑取單菌落于TSB液體培養(yǎng)基中，12 h后進(jìn)行DNA提取。采用水浴法提取培養(yǎng)后的菌液的DNA，10 000 r/min離心3 min后，加入50μL TE緩沖液（20 mmol/L Tris，2 mol/L EDTA，1.2%Triton X-100，pH=8.0），水浴100℃，10 min后進(jìn)行冰浴5 min，然后離心10 000 r/min，1 min取上清，上清即為DNA模板。

1.2.3 PCR方法的建立

建立PCR反應(yīng)體系（25μL），其中F3和B3分別標(biāo)記FITC和生物素，反應(yīng)體系如下。

表2 PCR反應(yīng)體系

避光條件下進(jìn)行PCR反應(yīng),反應(yīng)條件如下：

1.2.4 試紙條方法的建立

將制備好的金標(biāo)FITC抗體分別噴涂到金標(biāo)墊上，進(jìn)行37℃烘干備用。取樣品墊，吸水紙，硝酸纖維素膜，烘干的金標(biāo)墊依次粘貼到底板上，將多克隆抗體羊抗鼠IgG（1 mg/mL）和鏈霉親和素（1.5 mg/mL）用噴膜儀進(jìn)行1μL/cm進(jìn)行噴涂固定，將所獲得的試紙條存放于4℃下干燥備用，其中單獨(dú)出現(xiàn)C線為陰性結(jié)果，C、T線全出為陽性結(jié)果，單獨(dú)出現(xiàn)T線為無效結(jié)果。

1.2.5 特異性實(shí)驗的驗證

針對7株克魯諾桿菌和24株非克魯諾桿菌進(jìn)行特異性實(shí)驗，將24株非克魯諾桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)后，提取菌液的DNA然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將獲得的目標(biāo)PCR產(chǎn)物進(jìn)行特異性的試紙條驗證。

1.2.6 純培養(yǎng)物中的檢測

挑取單菌落進(jìn)行活化培養(yǎng)后，并二次活化培養(yǎng)12 h后的阪崎克魯諾桿菌菌液ATCC29544進(jìn)行梯度稀釋，將所獲得不同濃度的菌液（5.6×108,5.6×107,5.6×106,5.6×105,5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101mL-1）以及無克魯諾桿菌的培養(yǎng)液為陰性對照進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳法和試紙條檢測。

1.2.7 人工污染嬰幼兒奶粉中的檢測

選取1 g不含克魯諾桿菌的嬰幼兒配方奶粉溶于8 mL 0.85%的生理鹽水中，將梯度稀釋的克魯諾桿菌菌液以及無克魯諾桿菌的培養(yǎng)液為陰性對照進(jìn)行人工染菌實(shí)驗，獲得不同濃度污染奶粉的克魯諾桿菌的濃度（5.6×107,5.6×106,5.6×105,5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101g-1）以及無阪崎克魯諾桿菌的奶粉樣品為陰性對照，將所獲得的人工污染樣品，進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，所獲得的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物分別進(jìn)行電泳和試紙條檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 特異性實(shí)驗的驗證

針對7株克魯諾桿菌和24株非克魯諾桿菌進(jìn)行特異性實(shí)驗，將31株阪崎克魯諾桿菌和非克魯諾桿菌進(jìn)行活化培養(yǎng)后，提取菌液的DNA然后進(jìn)行PCR擴(kuò)增后試紙條檢測，得到7株克魯諾桿菌呈現(xiàn)陽性結(jié)果，24株非克魯諾桿菌呈現(xiàn)陰性結(jié)果，說明此方法特異性良好。

2.2 純培養(yǎng)物中的檢測

將所獲得不同濃度的菌液（5.6×105,5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101，5.6，5.6×10-1mL-1）以及無克魯諾桿菌的培養(yǎng)液為陰性對照，進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增后，所獲得的克魯諾桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行試紙條檢測最低檢測限為5.6×101mL-1。

圖1 純培養(yǎng)物中克羅諾桿菌的檢測結(jié)果

2.3 人工污染嬰幼兒奶粉中的檢測

將所獲得不同濃度人工污染奶粉的克魯諾桿菌的濃度（5.6×104,5.6×103,5.6×102,5.6×101,5.6 g-1）以及無克魯諾桿菌的奶粉樣品，進(jìn)行DNA提取和PCR擴(kuò)增，所獲得的克魯諾桿菌的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行試紙條檢測最低檢測限為5.6×102g-1。

圖2 人工污染嬰幼兒奶粉中克羅諾桿菌的檢測結(jié)果

3 結(jié)論

本研究通過設(shè)計無探針標(biāo)記的方式，并通過煮沸法快速提取菌液和嬰幼兒配方奶粉中的克魯諾桿菌，通過優(yōu)化PCR技術(shù)和試紙條方法快速檢測奶粉中的克魯諾桿菌，通過特異性標(biāo)記的FITC和生物素來特異性識別試紙條上的抗體，能夠高效快速的檢測奶粉中的克魯諾桿菌，研究表明，純培養(yǎng)物中克魯諾桿菌的檢測限為5.6×10 mL-1，而人工污染奶粉樣品中的克魯諾桿菌的檢測線為5.6×102g-1。本研究通過建立的PCR結(jié)合試紙條技術(shù)快速檢測嬰兒配方乳粉的克魯諾桿菌，舍棄了前人研究的設(shè)計探針的步驟，操作簡單，為食源性致病菌的快速檢測的提供一個新的研究方向和研究思路，并為核酸擴(kuò)增的檢測方式提供了新的研究思路，具有重要的研究價值。