抗真菌植物乳桿菌的篩選及其抗菌因素的研究

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特010018）

0 前言

12株植物乳桿菌為研究對象，采用雙層平板法對12株植物乳桿菌抗真菌特性進(jìn)行了初步評價，并對其無菌上清液在不同溫度和蛋白酶處理?xiàng)l件下的抑菌效果進(jìn)行了分析。

1 材料及方法

1.1 菌株及來源

實(shí)驗(yàn)中所用的12株植物乳桿菌保藏于內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種保藏庫(LABCC)，菌株及來源見表1。實(shí)驗(yàn)中采用的6株用于植物乳桿菌抑菌試驗(yàn)檢測的指示真菌的名稱及來源見表2。

1.2 實(shí)驗(yàn)所用培養(yǎng)基及試劑

1.2.1 培養(yǎng)基

乳酸菌活化及篩選培養(yǎng)基：MRS broth（OXOID，CM 0359）；MRSagar（OXOID，CM 0361）。

指示真菌培養(yǎng)基：Potato Dextrose Agar(PDA,Oxoid,CM 0139)。

1.2.2 試劑

PBS溶液，2 mol/L NaOH；胃蛋白酶，胰蛋白酶，蛋白酶K購于大連寶生物工程有限公司。

表1 實(shí)驗(yàn)所用菌株及來源

表2 指示真菌

1.3 儀器與設(shè)備

冷凍離心機(jī)（5810R型，德國Eppendorf公司），臺式高速離心機(jī)（TGL-16B型，德國Eppendorf公司），全自動高壓蒸汽滅菌器（HA-300M，日本Hirayama公司），恒溫水浴鍋（HWS28型，上海一恒科技有限公司），電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272型，上海一恒科技有限公司）BCD-245D型冰箱（青島海爾股份有限公司），12001型電子天平（上海天平儀器廠），HPS-250型生化培養(yǎng)箱（哈爾濱市東明醫(yī)療儀器廠制造）；雷磁PHS-3C pH計（上海精密科學(xué)儀器有限公司），SW-CJ-2FD潔凈工作臺（蘇凈集團(tuán)蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 抑真菌植物乳桿菌的篩選

采用雙層平板法[8]（di-layer medium method）對菌株進(jìn)行篩選，固體MRS作為下層培養(yǎng)基，待其凝固后，滴入3μL處于對數(shù)生長期的植物乳桿菌發(fā)酵液，于37℃培養(yǎng)24 h，每株菌做3個平行。真菌發(fā)酵液（106CFU/mL，OD 600=0.5）與半固體PDA培養(yǎng)基（瓊脂0.75%）混合后，作為上層培養(yǎng)基。24℃好氧條件下培養(yǎng)5 d，觀察抑菌圈大小，結(jié)果取平均值，分別以（-）（無抑制作用）；（+/-）（直徑＜1 mm）；（+）（直徑1-3 mm）；（++）（直徑＞3 mm）表示。

1.4.2 發(fā)酵上清液抑菌活性的測定

測定植物乳桿菌發(fā)酵上清液的抑菌活性時，采用瓊脂孔擴(kuò)散法[9]（Well-diffiision Agar Assay）。以真菌作為指示菌，在含有真菌孢子懸液的固體培養(yǎng)基上打孔，每孔中加入100μL植物乳桿菌無菌上清液，于4℃冰箱中擴(kuò)散2 h后置于24℃恒溫培養(yǎng)3～5 d。當(dāng)空白對照平板長滿真菌時，測量各樣品抑菌圈的大小（保留兩位有效數(shù)字）。

1.4.3 植物乳桿菌無細(xì)胞上清液抑菌活性的測定

將菌株于37℃培養(yǎng)18 h后離心（8 000 g，20 min，4℃），上清液過濾（0.22μm）。將過濾后的無菌上清液置于-80℃10 min，取一部分無菌上清液進(jìn)行如下處理：用2 mol/L NaOH中和菌液至p H=6.5。接下來，對每種中和的上清液進(jìn)行如下酶促和熱處理，分別加入胃蛋白酶（1 mg/mL），胰蛋白酶（1 mg/mL）和蛋白酶K（1 mg/mL），37℃敷育1 h，未進(jìn)行酶促處理的p H=6.5的無菌上清液為空白對照[10]。

另一部分無菌上清液用于溫度處理：在80℃敷育1 h，100℃敷育1 h，以未作任何處理的植物乳桿菌無菌上清液為空白對照[11]。

以上實(shí)驗(yàn)均運(yùn)用瓊脂孔擴(kuò)散法來測定菌株對真菌的抑菌活性。抑菌圈大小分別以（-）、（+/-）、（+）和（++）表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗真菌植物乳桿菌的篩選

以6株真菌為指示菌，采用雙層平板法由12株植物乳桿菌中篩選出對指示真菌抑菌效果較好的菌株，結(jié)果取平均值。結(jié)果顯示，92%的受試菌株對擴(kuò)展青霉有較強(qiáng)抑制作用，超過一半的菌株對黃曲霉、串珠鐮刀菌、產(chǎn)黃青霉、芽枝狀枝孢具有抑菌效果，僅有IMAU 40082和IMAU 60047對黑曲霉產(chǎn)生微量抑菌作用。具體結(jié)果如下（表3，圖1）。

表3 12株植物乳桿菌對指示真菌的抑制結(jié)果

2.2 植物乳桿菌發(fā)酵上清液抑菌活性的測定

為了表征植物乳桿菌的抗真菌活性化合物，通過瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)一步研究植物乳桿菌IMAU80095無菌上清液（CFS）的抑菌活性。將CFS進(jìn)行物理和化學(xué)處理，以排除或證實(shí)其抗真菌物質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)。

圖1 IMAU80095對6株真菌的抑菌效果

結(jié)果顯示，胰蛋白酶處理后的無菌上清液與未處理的上清液的抑制能力存在一定差異。經(jīng)過胰蛋白酶處理的CFS對黃曲霉、串珠鐮刀菌、擴(kuò)展青霉、產(chǎn)黃青霉和芽枝狀枝孢具有較小的抑制作用（＜1mm），對黑曲霉則表現(xiàn)為無抑制作用。然而，經(jīng)過胃蛋白酶和蛋白酶K處理的CFS與未處理的上清液的抑制能力完全相同，對6株真菌并無抑制。同樣，熱處理對抑制生長具有影響，高溫處理后的CFS（80℃，1 h和100℃，1 h）完全喪失抑菌作用，未作處理的無菌上清液明顯有抑菌圈。實(shí)驗(yàn)還證明，該化合物對p H的變化較敏感，無菌上清液在未調(diào)pH（酸性pH）下顯示出明顯的抗真菌活性，在將pH調(diào)至6.5時，抑菌活性降低，喪失了其拮抗性質(zhì)。

表4 IMAU80095發(fā)酵上清液抑制6種真菌活性結(jié)果

3 討論

絲狀真菌是廣泛存在的食品腐敗微生物，其在食品工業(yè)中造成重大經(jīng)濟(jì)損失，并且由于其潛在的產(chǎn)霉菌毒素的能力而與食品安全問題有關(guān)[12,13]。在過去的幾年中，人們開始廣泛地研究乳酸菌的抗真菌特性，乳酸菌也被添加到了食品中作為生物防腐劑使用[14]，這一措施有效的避免了由于物理防腐和化學(xué)防腐而帶來的不利影響。研究表明，植物乳桿菌已成為乳桿菌屬中抗真菌領(lǐng)域的重要參與者[15]，對多種真菌均具有抑制作用。

本研究中選用的12株植物乳桿菌分離自內(nèi)蒙古、青海省、四川省等5個地區(qū)，分離于發(fā)酵乳、泡菜、曲拉等發(fā)酵制品中；6株指示真菌也均分離于燕麥、水果、干酪等食品中。研究中的每株植物乳桿菌對于指示真菌表現(xiàn)出較大的差異，其中，植物乳桿菌能夠較大程度的抑制串珠鐮刀菌、擴(kuò)展青霉、產(chǎn)黃青霉和芽枝狀枝孢，而對黑曲霉幾乎無抑制作用。在Cheong的研究中，有12株植物乳桿菌對曲霉屬、青霉屬和枝孢菌屬的物種顯示出抗真菌活性[16]。Magnusson等[17]報道了類似的結(jié)果，他分析了1 200株乳酸菌，發(fā)現(xiàn)了幾株植物乳桿菌對曲霉菌，青霉菌和鐮刀菌屬具有強(qiáng)抑制活性，但對P.roqueforti不起作用。最近，Crowley等人[18]對約7 000株乳酸菌進(jìn)行的大規(guī)模篩選表明，大多數(shù)植物乳桿菌能夠抑制擴(kuò)展青霉的生長。以上研究結(jié)論與本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果較為吻合。

乳酸菌抗菌活性一般直接通過含活細(xì)胞的菌液來表達(dá)，或者由于生長過程中產(chǎn)生的各種活性拮抗代謝物而間接表達(dá)。因此，植物乳桿菌分離物含活細(xì)胞的菌液表現(xiàn)出廣泛的抗真菌活性譜。進(jìn)一步研究中，采用瓊脂擴(kuò)散法將CFS加入PDA平板中，是建立乳酸菌CFS抗真菌活性的快速方法。植物乳桿菌對真菌的抑制活性在不同的時間內(nèi)實(shí)現(xiàn)，并且由不同的因素引起。早期階段的抑菌活性是在發(fā)酵過程中實(shí)現(xiàn)的，是由于菌株在生長過程中產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物而產(chǎn)生抑菌效果。研究者將植物乳桿菌的抗真菌化合物純化，分離出的這些物質(zhì)有苯乳酸、蛋白質(zhì)和脂肪酸等。晚期階段，在細(xì)胞生長結(jié)束時發(fā)現(xiàn)，肽化合物的釋放也可能對真菌產(chǎn)生抑制作用，因?yàn)榧?xì)胞自溶是所有菌株常見的特征。

在研究植物乳桿菌IMAU 80095的活性抗真菌化合物時發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過胰蛋白酶處理的CFS對黃曲霉、串珠鐮刀菌、擴(kuò)展青霉、產(chǎn)黃青霉和芽枝狀枝孢具有較小的抑制作用（＜1 mm），對黑曲霉則無抑制。胃蛋白酶和蛋白酶K處理的CFS對6株真菌并無抑制，與未處理的上清液的抑制能力完全相同。目前，有很多研究發(fā)現(xiàn)了對真菌和酵母具有抑制作用的蛋白類物質(zhì)，它們的數(shù)量遠(yuǎn)低于對細(xì)菌有抑制作用的蛋白類物質(zhì)，如各種細(xì)菌素等[19]。最初的研究發(fā)現(xiàn)，利用蛋白酶對乳酸菌發(fā)酵上清液進(jìn)行處理會造成抑真菌特性的損失，后來通過進(jìn)一步研究更加深入的了解了這些蛋白質(zhì)的特性[20]。這一結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)接近。同樣，熱處理對植物乳桿菌上清液抑制真菌生長具有影響，本實(shí)驗(yàn)中，高溫處理過的CFS完全喪失抑菌作用，未作處理的無菌上清液明顯有抑菌圈。熱處理可能會對上清液的抑菌物質(zhì)造成影響進(jìn)而引起菌株抑菌能力的丟失。實(shí)驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，IMAU80095的活性抗真菌化合物對pH的變化較敏感，將pH調(diào)至6.5時，抑菌活性明顯降低，證明其抑制能力可能與低p H的有機(jī)酸相關(guān)，這些有機(jī)酸可能為苯乳酸、乳酸、醋酸等。

目前的研究由于缺乏分離少量活性代謝物的合適測定方法，大多數(shù)化合物仍待鑒定。因此，進(jìn)一步的研究應(yīng)致力于發(fā)展有效的方法檢測抗真菌代謝物的復(fù)雜生物系統(tǒng)，控制抗真菌化合物的最佳條件，以使其更好的抑制真菌，保證食品的安全性。