超聲波改性酪蛋白后其特性的變化及其在凝固型酸奶凝膠中的應用

趙璞，張書文，劉鷺，逄曉陽，蘆晶，呂加平

（中國農業科學院農產品加工研究所，北京100193）

0 引言

酪蛋白存在于復雜的牛乳體系中，其在牛乳中為含量最多的蛋白質，約占80%～82%[1]。酪蛋白濃度較低時其分子主要以單體形式存在，但牛乳中的酪蛋白分子則通過疏水相互作用、氫鍵以及離子鍵等作用而形成膠束結構[2]，因此分離出的酪蛋白幾乎不溶于水。酪蛋白是一種含磷蛋白質，與Ca2+結合可以使微粒結構穩定[3]，而這也是酪蛋白在乳中以膠體粒子形式存在的一個原因。酪蛋白具有蛋白質所具有的三大功能特性即水合性質、結構性質以及表面性質[4]。其中溶解性的高低是酪蛋白其他功能特性優劣差異的前提，其他性質的測定都是在酪蛋白溶解后的基礎上所進行研究的，因此，選擇一種物理方法對酪蛋白進行改性使其溶解性增加則能夠更加有利于對其其他性質的研究。改性較變性往往能夠使目的蛋白獲得更好的功能特性，而超聲破碎的方法將電能轉化為聲能，利用空穴效應使其產生的極高的能量破碎細胞或其他物質[5]。因此相對于化學方法，生物酶法更加安全、簡便、可靠。

牛乳除用作生產乳制品的原料還可用于生產功能性配料，如干酪素、乳清蛋白等。因此若能將牛乳及其成分充分利用則可減少近幾年頻繁發生的“倒奶殺牛”事件的幾率。本文通過設計梯度超聲處理，并測定超聲處理后的酪蛋白的多種功能性質：溶解性、乳化性及乳化穩定性并進行分析，通過粒度的變化以及蛋白質二級結構的變化側面反應酪蛋白功能特性的變化原因。另外，本文將超聲處理后的酪蛋白應用于凝固型酸奶凝膠的制作中，發現其可提高酸奶的凝膠性質。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

酪蛋白膠束粉（實驗室）；脫脂乳粉（新西蘭進口）；大豆油（市售）；乳酸菌酸奶發酵劑（丹麥進口）；丙烯酰胺、過硫酸銨（均為分析純，國藥集團化學試劑有限公司）；四甲基乙二胺（美國aMResco公司）；考馬斯亮藍R 250（北京廣達恒益有限公司）；蛋白質Marker（天根生化科技有限公司）；SDS（美國Sigma公司）等。

1.2 儀器與設備

YP2001N型電子分析天平（上海精密科學儀器）；JY92-IIN型超聲波細胞破碎儀（寧波新芝生物科技股份有限公司）；DK-S24型電熱恒溫水浴鍋（上海森信實驗儀器）；DHG-9123A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設備）；RCT basic型磁力攪拌器（上海京工實業有限公司）；漩渦混合器MVS-1（北京金北德工貿海爾）；DELTA 320 p H計（瑞士梅特勒-托利多股份）；DDS-307型電導率儀上海精科實驗儀器有限公司；3K-15離心機（美國Sigma公司）；UV-2300型紫外可見分光光度計（上海天美科學儀器）；T18型乳化剪切儀（上海京工實業有限公司）；Zetasizer Nano 2S型Zeta-電位儀（英國馬爾文儀器公司）；MOS-450/AF-CD型圓二色譜分析儀（法國Bio-Logic公司）；FluorChemFC2凝膠成像系統（美國Alpha公司）；TA-XT2i型質構儀（英國Stable Micro System公司）；EPS301電泳儀（美國GEhealthcare公司）；脫色搖床TS-1（Orbital shaker）。

1.3 方法

1.3.1 酪蛋白溶液的配制

從牛乳中分離出的酪蛋白具有膠束狀結構，其溶解性極低，實驗證明，0.5%即為其飽和溶液。但由于其在牛乳體系中濃度約為3%，且0.5%的濃度過低，對工業生產應用起到的效果并不顯著，因此模擬牛乳體系配制3%的酪蛋白溶液。

1.3.2 超聲波梯度處理酪蛋白溶液

根據前人實驗的經驗值[6]設定實驗梯度，分別取100 mL、3%的酪蛋白溶液在相同時間5 min作用下，進行200，400，600，800四個不同功率的處理；同樣，在相同功率400W條件下，進行5，10，15，20四個不同時間的處理。采用超聲間歇工作模式（工作6 s，間隔停歇4 s）。將處理好的酪蛋白溶液于4℃保存，檢測前恢復至室溫。為保證處理溫度不因超聲處理過程中所產生大量的熱而達到酪蛋白變性的溫度，因此處理過程中加以冰浴。

1.3.3 p H和電導率的測定

分別用pH計和電導儀進行超聲處理后的酪蛋白溶液pH值和電導率的測定并記錄，溫度為室溫。

1.3.4 溶解性的測定

參考Carr A J[7]的方法，將其進行改進如下：取

1.3.2 超聲處理樣品凍干后配制成5%的溶液，分別取10 g溶液于50 mL離心管中，配平后于24℃條件下，轉速8 000 r/min離心15 min。離心后迅速將上清液取出至10 mL離心管中，取上清液2 g（m0）置于已恒重的平板（m1）中，同時稱取未離心原樣2 g于預先恒重的平板（m2）中，將平板同時于105℃烘箱中烘干2 h直至恒重，取出后于干燥器中冷卻至室溫并稱重（m3，m4），之后按照下式計算溶解性。

1.3.5 乳化性和乳化穩定性的測定

用濁度法[8]測定乳化能力（EAI）和乳化穩定性（ESI）。取9 mL、3%酪蛋白溶液與3 mL大豆油混合，13 500 r/min乳化2 min，立即從燒杯底部取出50μL乳狀液與5 mL、0.1 g/100 mL的SDS溶液混合，500 nm下測定吸光值A0，靜置30 min后按相同方法測定乳狀液吸光值A30。按照下式進行計算并分析結果。

其中:T=2.303;N為稀釋倍數;c為乳狀液形成前蛋白質量濃度，g/mL;ψ為乳狀液中油的體積分數。

1.3.6 粒度的測定

利用Zeta-電位儀來測定酪蛋白溶液中顆粒粒徑的大小，將樣品濃度稀釋至0.1%后于該儀器中測定溶液顆粒粒徑。

1.3.7 圓二色譜分析二級結構變化

將超聲處理后的酪蛋白溶液加入0.1 cm厚的橢圓形比色皿中，以去離子水作為空白，測定后通過CDPro軟件分析得到酪蛋白二級結構的具體組成以及各組成的含量變化。

1.3.8 凝膠的形成及TPA性質的測定

1.3.8.1 凝膠的形成

在經過超聲處理的濃度為3%的30 mL酪蛋白溶液中分別添加脫脂乳粉3.3 g，使其非脂固形物含量為10%，磁力攪拌15 min，90℃水浴殺菌10 min，冷卻至室溫后，添加0.1%直投式乳酸菌（保加利亞乳桿菌和嗜熱鏈球菌）即0.03 g，混勻后放于45℃水浴鍋中前發酵6 h，拿出后放于4℃冰箱中冷藏14 h進行后熟備用。

1.3.8.2 凝膠TPA性質的測定

選擇P0.5R的探頭，測前、測中、測后速度均為1.0 mm/s，感應力設為5 g，測試距離為10 mm[9]；將制作好的酸奶凝膠于質構儀下進行TPA的測定，得出數值后，按照軟件中公式進行粘附性、彈性、凝聚性、回復性等性質的計算與分析。

1.3.9 數據處理

各實驗重復2次，數據在p＜0.05水平上的顯著性采用IBM SPSS 22.0統計軟件進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 超聲波對酪蛋白pH與電導率的影響

400W超聲處理不同時間酪蛋白pH和電導率的變化結果如表1和圖1所示，不同功率超聲處理5 min酪蛋白該性質的變化結果如表2和圖2所示。

p H值可以直觀的反應出溶液的酸堿性，牛乳的p H值一般為6.6左右[10]，而酪蛋白膠束溶液的p H值則在7.0左右，偏弱堿性。如表1所示，超聲處理酪蛋白溶液后其pH較未超聲處理的酪蛋白有不同程度的提高，但統計學上并不顯著。電導率能夠反應溶液中離子導電性的強弱，而由圖1可看出電導率呈下降的趨勢，這與pH不同程度的升高所帶氫離子濃度降低結果一致。而溶液黏度的增加也可使電導率下降[6]。

表1 400W超聲處理不同時間酪蛋白pH值的變化結果

表2 不同功率超聲處理5 min酪蛋白該性質的變化結果

圖1 400 W超聲處理不同時間（a）以及不同功率超聲處理5 min（b）溶液電導率的變化

2.2 超聲波對酪蛋白溶解性的影響

溶解性是蛋白質功能性質的前提和基礎，其結果可為酪蛋白其它功能性質的變化做理論依據。400 W超聲處理不同時間酪蛋白溶解性的變化以及不同功率超聲處理5 min酪蛋白該性質的變化結果如圖2所示。結果表明，不同條件超聲處理酪蛋白溶液其溶解性均增加。400 W超聲波處理酪蛋白溶液，5 min處理后溶解性即有顯著性的升高（P＜0.05），隨著時間的延長，溶解性增加并趨于平緩，而不同功率超聲處理5 min后溶液的溶解性基本呈線性增加，這與孫彥君[6]等人研究的超聲處理MPC70（乳蛋白濃縮物）的結果一致，可能是由于超聲波的空穴效應產生的能量使得蛋白質的親水性氨基酸從內部暴露，增加了與水的相互作用從而增加了酪蛋白的溶解性[11]。而Wang等人[12]用超聲處理蛋白質溶液，發現可明顯提高蛋白質的親水性和溶解性，并解釋為是由于超聲使蛋白分子分解，并使蛋白質懸浮液乳化所造成；而超聲波的機械效應使得酪蛋白顆粒粒徑減小，也可增大其與水的接觸面積從而增加了酪蛋白的溶解性。

圖2 400 W超聲處理不同時間（a）以及不同功率超聲處理5 min（b）溶液溶解性的變化

2.3 超聲波對酪蛋白乳化性和乳化穩定性的影響

乳化性是衡量蛋白質功能的性質之一，它能夠表現出蛋白質與油相的結合能力。400 W超聲處理不同時間酪蛋白乳化性等的變化以及不同功率超聲處理5 min酪蛋白該性質的變化結果分別如圖3和圖4所示。結果表明，隨著時間的延長和功率的增加，超聲處理后溶液的乳化性呈增加趨勢并具有顯著性（P＜0.05），而乳化穩定性雖有下降現象，但整體仍有增強的趨勢。可能的原因是，酪蛋白由于其本身的結構特點，肽鏈上高度親水區域和高度疏水區域是相對分開的，故酪蛋白本身是一種很好的乳化劑；超聲處理后溶液的溶解性增強，而乳化性等與溶解性成正相關[2]，故其乳化性和乳化穩定性均呈增強趨勢。

圖4 不同功率超聲處理5min酪蛋白溶液乳化性及乳化穩定性的變化

2.4 超聲波對酪蛋白粒度的影響

溶液中分子粒度的變化可用來解釋一些蛋白質功能性質的變化原因。400W超聲處理不同時間酪蛋白溶液粒徑的變化以及不同功率超聲處理5min酪蛋白溶液粒徑的變化結果如表3所示。結果表明，用200W的功率或400W超聲處理5min后溶液的粒徑便由原來的10.112μm顯著減小到0.3μm左右，而隨著處理時間或功率的增加，粒徑也有所減小，但趨于平緩。可能的原因是超聲波的機械剪切力使得酪蛋白膠束破壞從而使其粒徑減小[13]。從粒徑分布的角度來看，樣品粒徑由未處理的10～100μm降至0.1～1μm，由此可知，超聲處理后的樣品粒徑分布范圍顯著減小。

表3 不同條件超聲處理對酪蛋白粒徑的影響

2.5 圓二色譜法分析酪蛋白二級結構的變化

利用圓二色譜儀測定酪蛋白二級結構的變化，通過分析其變化大小判斷超聲對其結構的影響，結果如表4所示。酪蛋白二級結構中β-折疊和無規則卷曲所占比例最高，分別占36%和33%，而α-螺旋結構比例最少約為4%，這與石燕等人[14]的研究結果較為一致，但各結構的含量有些差別，這可能與樣品制備、處理檢測方法不同有關。α-螺旋結構經超聲處理后其所占比例減少，可能是超聲波空穴作用產生的局部高溫影響的[15]。也可能是超聲波處理后酪蛋白分子中的螺旋結構部分展開，使得蛋白質分子柔順性增加，而這也可能是酪蛋白乳化性改變的內在因素[14]。其他結構中，β-折疊與β-轉角結構無顯著變化，而無規則卷曲結構有一定的變化但并無明顯規律。從馮景麗[16]等人的電鏡結果來看，造成的原因可能是超聲波破壞的是酪蛋白膠束，使膠束解離，但未涉及到二級結構的破壞。

表4 不同條件超聲處理后酪蛋白二級結構的變化

2.6 超聲波處理酪蛋白對其在凝固型酸奶凝膠中的影響

蛋白質的膠凝特性是蛋白質功能特性中一個重要的性質，膠凝性能的提高可以為其帶來更多工業上的應用，如乳蛋白制作成的涂料、油漆等。超聲處理酪蛋白后其所制作的酸奶凝膠與未處理蛋白樣品制作的凝膠TPA性質對比如圖5和圖6以及其他凝膠性質如表5所示。

質構儀中的TPA模式可以測定凝膠的柔軟度、黏附性、硬度、彈性、凝聚性、回復性等指標，其中彈性與回復性相似，均可以說明物體受到擠壓并快速恢復變形的能力，它們與凝聚性的數值均＜1，且越接近于1，凝膠特性越好；柔軟度是探頭達到一定作用力時下行樣品的深度，該值越大說明樣品越軟；對于凝固型酸奶這一需要面向市場消費群眾的消費品，考慮到人食用其的方便性，其硬度越小越好，而凝聚性和黏度則越大越好[17-18]。

隨著超聲處理時間和功率的增加，酸奶凝膠的黏附性增加，硬度降低，凝聚性和彈性均顯著增加而回復性和柔軟度并無顯著變化。其中以硬度和黏度作為評價標準，則600W、5min以及400W、15min處理的酪蛋白形成的酸奶凝膠質構性質最佳，且優于未處理的酪蛋白溶液配制的脫脂乳粉制作的凝膠的性質，可據此將其應用于凝固型酸奶的制作中。

圖6 不同功率超聲處理5 min溶液粘附性和硬度的變化

表5 不同條件超聲處理后凝膠性質的變化

3 結論

本文通過不同時間和功率的超聲處理對酪蛋白進行改性，檢測并分析其性質變化原因。結果表明：

（1）隨著超聲處理中時間和功率的增加，酪蛋白溶液的pH未發生顯著變化，呈弱堿性；電導率則呈下降的趨勢；酪蛋白功能性質中溶解性、乳化性以及乳化穩定性都有不同程度的提高；溶液粒徑顯著減小；二級結構并無顯著變化。

（2）超聲處理影響酪蛋白膠束的大小及酪蛋白各個蛋白之間的作用，超聲波空穴效應產生的能量使得酪蛋白膠束解離，降低其膠束大小，并使其中的親水基團暴露，增加其溶解性，而對酪蛋白二級結構影響較小。

（3）超聲處理的酪蛋白形成的酸奶凝膠性能較未處理的有顯著提高，且超聲600 W、5 min以及400 W、15 min處理的酪蛋白形成的酸奶凝膠質構性質最佳，可據此將其用于工業生產中。