高效液相色譜法測定雞肉中土霉素、四環素、金霉素和強力霉素殘留量的方法優化探討

◎ 夏潔貞，區敏霞

（佛山市高明區農業技術服務推廣中心，廣東 佛山 528500）

四環素類抗生素（Tetracyclines）是由放線菌產生的一類廣譜抗生素，包括金霉素（Chlortetracycline)、土霉素（Oxytetracycline）、四環素（Tetracycline）及半合成衍生物甲烯土霉素、強力霉素和二甲胺基四環素等，其結構均含并四苯基本骨架。

近年來，抗生素在醫療和畜禽養殖業中的大量使用所導致的環境污染問題日趨嚴重，已成為國內外研究的熱點之一。四環素類抗生素由于價格低廉，大量使用于許多疾病的預防與促進動物的生長，提高畜禽生產效率，獸用抗生素的使用大大促進了養殖業快速發展。同時由于四環素類抗生素相對穩定，具有一定的持久性，造成環境中四環素類抗生素的殘留，從而間接或直接進入人體，增加人體的耐藥性，給人類公共健康帶來威脅[1]。為了保護環境和人身健康，許多國家都嚴格規定了四環素類抗生素在飼料中的添加限量及動物食品中的檢出限量，我國也制定了國家標準規定四環素類抗生素的添加限量。目前，測定四環素類抗生素殘留量的方法多種多樣，參照國標要求本實驗室根據實際情況利用高效液相色譜法測定畜禽肉中四環素類抗生素的殘留量[2]，并對該方法進行了優化。

1 實驗部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀（配備四元泵，自動進樣系統）、柱溫箱、DAD檢測器、XDB-C18色譜柱、電子天平、離心機、高速分散器、漩渦振蕩器、固相萃取裝置、旋轉蒸發儀、HLB固相萃取柱和WCX陽離子交換柱。

鹽酸土霉素、鹽酸四環素、鹽酸金霉素和鹽酸強力霉素標準品、磷酸二氫鈉溶液、0.2 mol/L磷酸二氫納溶液、0.1 mol/L檸檬酸溶液、Mcllvaine緩沖溶液、Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液、甲醇水溶液、標準儲備液、混合標準工作液。

1.2 樣品的制備

1.2.1 提取

稱取6.00 g±0.01 g雞肉樣品于50 mL離心管內，加入30 mL 0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine緩沖溶液，用高速分散器以10000 r/min均質1 min，于漩渦振蕩器上震蕩提取10 min，以10000 r/min離心10 min。把上清液倒入另一離心管中，殘渣再加入20 mL緩沖液，重復提取一次，合并上清液。

1.2.2 凈化

上清液以≤3 mL通過連接HLB柱的固相萃取裝置，待上清液完全流出后，用甲醇水溶液5 mL洗柱，棄去全部流出液，真空抽干20 min，最后用15 mL乙酸乙酯洗脫，收集洗脫液，再將洗脫液以≤3 mL通過連接WCX柱的固相萃取裝置，待洗脫液全部流出后，用5 mL甲醇洗柱，棄去全部流出液，減壓抽干5 min，再用4 mL流動相洗脫，洗脫液過0.45 μm濾膜，濾液供液相色譜測定。

1.3 樣品的測定

1.3.1 色譜條件

色譜柱：XDB- C18柱（150 mm×4.6 mm id，5μm），色譜柱；流動相：乙腈+甲醇+0.01 mol/L草酸溶液（2+1+7）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25 ℃；檢測波長：350 nm；進樣量：50 μL。

1.3.2 標準曲線的制定

在1.3.1的色譜條件下對配制的標準系列溶液進樣測定并繪制標準曲線，見圖1～圖4，標準品色譜見圖5。

圖1 土霉素標準曲線圖

圖2 四環素標準曲線圖

圖3 金霉素標準曲線圖

圖4 強力霉素標準曲線圖

圖5 100ng/mL的標準品色譜圖

1.3.3 樣品測定

在1.3.1的色譜條件下對凈化后的濾液進樣測定，外標法定量。空白樣品色譜圖參見圖6，樣品加標色譜圖見圖7。

圖6 空白樣品色譜圖

圖7 樣品加標色譜圖

2 結果與分析

2.1 標準曲線的線性分析

在1.3.1的色譜條件下，分別對混合標準系列溶液進行分析，得到符合分析要求的線性，線性回歸方程、相關系數和線性范圍參見表1。

表1 標準曲線的線性回歸方程、相關系數和線性范圍表

2.2 樣品分析

本次樣品選用養殖場的雞肉15份，按照1.2方法制備樣品溶液，在1.3.1的色譜條件下測定，外標法定量，結果表明，所有樣品中4種四環素類抗生素的殘留量均小于5 μg/kg。

3 討論

3.1 色譜條件

本實驗方法是對多種國標液相色譜方法[3]進行比較，最后參照GB/T 20764-2006《可食動物肌肉中土霉素、四環素、金霉素、強力霉素殘留量測定 液相色譜-紫外檢測法》[3]，選用的XDB-C18柱和流動相比例也可以對標準品和樣品實現基線分離，達到較理想的分離效果，同時減少了梯度洗脫的繁瑣，縮短分析時間。

3.2 線性和檢出限

在1.3.1色譜條件下對標準系列溶液進行分析繪制的標準曲線線性能達到分析要求，實驗結果顯示4種四環素類抗生素的添加回收均達80%以上，本方法4種四環素類抗生素的檢出限均能達到5 μg/kg。

3.3 方法的利弊

目前土霉素、四環素、金霉素和強力霉素的檢測方法有生物檢測法[4]和化學檢測法。生物檢測法雖然快速，但消耗的試劑盒量大價格昂貴且出現假陽性的幾率較高，只適用于大批量樣品的快速篩選，因此國際公認的確證方法仍是化學分析法。目前最常用的化學檢測方法主要有高效液相色譜法[3,5]和高效液相質譜聯用法[6]，其中農業部1025號公告-12-2008《雞肉、豬肉中四環素類藥物殘留檢測 液相色譜-串聯質譜法》[6]適用于豬肉、雞肉中四環素、土霉素及金霉素的殘留檢測靈敏度高，檢測快速，該方法檢測限為5 μg/kg，定量限為10 μg/kg，回收率在60%～120%，但是儀器價格昂貴使其廣泛應用受到限制。而本法是普遍使用的高效液相色譜儀，根據4種物質的保留時間不同，然后通過DAD檢測器在350 nm波長檢測，同時實現了4種物質的檢測，具有儀器成本相對較低，靈敏度高，定量準確，檢出限達到5 μg/kg。不足之處是在提取和凈化的過程中步驟復雜耗時長，但是本法相較于其他液相方法[2,7]凈化效果比較好，樣品基質雜質干擾小，今后仍需不斷改進。