IL-35在特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型中的表達(dá)

王 倩 劉 偉 薛 競(jìng) 王 勤 張麗霞

特應(yīng)性皮炎(atopic dermatitis, AD)是一種常見(jiàn)的慢性、復(fù)發(fā)性、炎癥性皮膚病，主要表現(xiàn)為濕疹樣皮炎、頑固性瘙癢及皮膚干燥、皮膚屏障損害，病程中常伴有哮喘和/或過(guò)敏性鼻炎。在過(guò)去的二三十年間，全球AD的患病率大幅度增加，有學(xué)者回顧了1990-2010年間的69項(xiàng)研究，顯示在部分發(fā)達(dá)國(guó)家兒童AD患病率已高于20%，并且在非洲、東亞等發(fā)展中國(guó)家患病率也在增高[1]。AD確切發(fā)病機(jī)制未明，但免疫失衡已被認(rèn)為在其發(fā)病中起重要作用。近年研究發(fā)現(xiàn)，除Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)外，Th17/Treg細(xì)胞之間平衡狀態(tài)的打破也可能是關(guān)鍵因素。IL-35作為一種由Treg細(xì)胞分泌的新抑制性細(xì)胞因子在炎性疾病中的作用開(kāi)始受到重視，但I(xiàn)L-35與AD發(fā)病的關(guān)系目前尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究旨在利用特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型初步探討IL-35在特應(yīng)性皮炎發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及試劑 4～6周齡SPF級(jí)BALB/c雌性小鼠30只(成都達(dá)碩生物科技有限公司)；2, 4-二硝基氟苯(DNFB，美國(guó)Sigma公司)；小鼠IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17 ELISA試劑盒(上海鑫樂(lè)生物科技有限公司)；TRIZOL(美國(guó)Invitrogen公司)；PrimeScript RT reagent Kit[寶生物工程(大連)有限公司]；SYBR Premix Ex Taq II Kit[寶生物工程(大連)有限公司]；引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司設(shè)計(jì)合成，序列為：IL-12p35上游引物5’-CATCTGGCGTCTACACTGCTGCTGAA-3’，下游引物5’-ACTGAGGTGGTTTAGGAGGGCAAGGG-3’；EBI3上游引物5’-TCCAAGGAACAGAGCCACAGAGCAT-3’，下游引物5’-TGAAGGACGTGGATCTGGTGGAGTTG-3’；酶標(biāo)儀(型號(hào)Multiskan Mk3，美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)；實(shí)時(shí)熒光定量(RT-PCR)儀(型號(hào)PikoReal，美國(guó)ThermoFisher儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 特應(yīng)性皮炎動(dòng)物模型的建立 參照本研究小組既往實(shí)驗(yàn)建立模型[2]：小鼠先在恒溫恒濕清潔級(jí)環(huán)境中飼養(yǎng)2周，適應(yīng)環(huán)境之后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前用8%硫化鈉淀粉溶液脫去小鼠背部面積約2 cm×4 cm毛發(fā)。將30只小鼠隨機(jī)分為模型組及對(duì)照組，每組15只。模型組用丙酮：橄欖油3∶1溶液作為基質(zhì)配置0.5% 2,4-二硝基氟苯(DNFB)，0.5%DNFB 100 μL外涂背部進(jìn)行2次誘導(dǎo)(實(shí)驗(yàn)第1天和第2天各涂搽一次)，實(shí)驗(yàn)第2周(第7天)起每隔2天背部涂搽1次，每次70 μL，第28天涂搽后造模完成。對(duì)照組小鼠背部脫毛區(qū)給予等量基質(zhì)(丙酮∶橄欖油3∶1)，時(shí)間及涂搽劑量與實(shí)驗(yàn)組一致。

1.2.2 血清IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17水平的檢測(cè) 造模成功后，兩組小鼠經(jīng)腹腔注射10%水合氯醛1 mL/kg麻醉后摘除右側(cè)眼球取血，將收集的血液于37℃靜置30 min后以3500 r/min離心15 min，分離收集上層血清，-80℃保存。血清中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17濃度采用生物素雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，于450 nm處測(cè)量吸光度值，使用相關(guān)軟件繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算血清樣本中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17的含量。

1.2.3 組織學(xué)形態(tài)觀察 無(wú)菌條件下取兩組小鼠背部皮膚組織，約1 cm×0.5 cm，以10%甲醛固定，常規(guī)石蠟包埋、切片，觀察兩組小鼠背部皮膚組織學(xué)改變。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)皮膚組織中IL-12p35 mRNA及EBI3 mRNA水平 無(wú)菌條件下取兩組小鼠背部皮膚組織，約0.5 cm×0.5 cm，迅速冷凍在液氮中，再放入-80℃保存。之后在液氮條件下研磨組織至粉末狀，將粉末倒入去RNA酶的EP管中，加入1 mL TRIZOL，再用TRIZOL法提取小鼠皮膚總RNA。按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄及RT-PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系如下：SYBR Premix Ex Taq II 10.0 μL，上、下游引物各0.4 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 6.4 μL。反應(yīng)條件：以95℃ 30 s預(yù)變性，95℃ 5 s變性，55℃ 30 s退火，72℃ 30 s充分延伸，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣本設(shè)三個(gè)復(fù)孔，取其平均Ct值，以β-actin為內(nèi)參，通過(guò)2-△△Ct計(jì)算IL-12p35、EBI3的mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 模型組小鼠背部皮損表現(xiàn)及組織病理學(xué)改變 對(duì)照組小鼠背部皮膚正常(圖1a)，模型組小鼠背部可見(jiàn)紅斑、丘疹、滲出、漿痂、增厚、苔蘚樣變等改變(圖1b)。對(duì)照組小鼠背部皮膚組織鏡下結(jié)構(gòu)基本正常(圖2a),模型組小鼠背部皮膚組織鏡下可見(jiàn)角化過(guò)度伴角化不全、棘層增厚、海綿水腫、真皮淺層淋巴細(xì)胞為主的炎細(xì)胞浸潤(rùn)等特應(yīng)性皮炎樣改變(圖2b)。

2.2 模型組小鼠及對(duì)照組小鼠血清中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17的表達(dá) 模型組小鼠血清中IL-35濃度明顯低于對(duì)照組[(326.39±27.19)pg/mL vs. (362.78±59.64)pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠血清中IL-4、IL-17濃度均明顯高于對(duì)照組[(33.98±3.92)pg/mL vs. (29.93±4.41)pg/mL，(257.50±26.14)pg/mL vs. (179.61±36.43)pg/mL]，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；模型組小鼠血清中IFN-γ濃度較對(duì)照組有所降低，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[(371.22±39.18)pg/mL vs. (398.98±48.69)pg/mL，P>0.05]。見(jiàn)表1。

2.3 模型組小鼠血清中IL-35濃度與IL-4、IFN-γ、IL-17濃度的相關(guān)性 將模型組小鼠血清中IL-35濃度與IL-4、IFN-γ、IL-17濃度進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果顯示IL-35與IL-17呈負(fù)相關(guān)(r=-0.611，P=0.015)；而與IL-4、IFN-γ無(wú)明顯相關(guān)性(r=-0.117, 0.435，P=0.679,0.106)。

2.4 模型組小鼠及對(duì)照組小鼠背部皮膚組織中IL-35亞單位(IL-12p35及EBI3)mRNA的表達(dá) IL-12p35mRNA在模型組小鼠背部皮損中的相對(duì)表達(dá)量(0.57±0.37)明顯低于對(duì)照組(1)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.461，P=0.021)；EBI3 mRNA在模型組小鼠背部皮損中的相對(duì)表達(dá)量(0.65±0.55)也較對(duì)照組(1)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=-2.074，P=0.047)；且模型組小鼠背部皮損中IL-12p35 mRNA與EBI3 mRNA表達(dá)呈顯著正相關(guān)(t=0.962，P=0.000)。見(jiàn)圖3。

表1 模型組及對(duì)照組血清中IL-35、IL-4、IFN-γ、IL-17表達(dá)水平的比較

圖1 對(duì)照組(1a)及模型組(1b)小鼠背部皮膚表現(xiàn) 圖2 對(duì)照組(2a)及模型組(2b)小鼠背部皮膚組織病理表現(xiàn)(HE，×200)

圖3 對(duì)照組及模型組小鼠背部皮膚IL-12p35(3a)及EBI3 mRNA(3b)相對(duì)表達(dá)量，*P<0.05

3 討論

特應(yīng)性皮炎(AD)是一種慢性、反復(fù)性、炎癥性皮膚病，瘙癢劇烈，常伴有哮喘和/或過(guò)敏性鼻炎，嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量。AD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，涉及遺傳、免疫、環(huán)境、感染、生理病理等多種因素。目前已有大量研究證實(shí)Th1/Th2細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)失衡是AD的發(fā)病基礎(chǔ)[3,4]。此外，促進(jìn)炎癥反應(yīng)的Th17細(xì)胞和抑制炎癥反應(yīng)的Treg細(xì)胞之間的細(xì)胞平衡是機(jī)體維持免疫穩(wěn)態(tài)的重要因素，其平衡的打破也可能在AD的發(fā)病中占有重要地位[5]。

IL-35是近年新發(fā)現(xiàn)的一種抑制性細(xì)胞因子，于1990年被發(fā)現(xiàn)，2007年由Collison等[6]命名。IL-35為IL-12家族的新成員，是由IL-12p35(IL-12A)亞基與EB病毒誘導(dǎo)基因3(EpsteinBarr virus-induced gene 3，EBI3)蛋白組成的異源二聚體，主要由Treg細(xì)胞分泌。IL-35是Treg細(xì)胞發(fā)揮免疫抑制效應(yīng)必需的，其性質(zhì)穩(wěn)定，在體內(nèi)外能抑制傳統(tǒng)T細(xì)胞的增殖并誘導(dǎo)幼稚T細(xì)胞轉(zhuǎn)換成iTreg，具有強(qiáng)大的免疫抑制作用[7,8]。近年研究發(fā)現(xiàn)IL-35在血液系統(tǒng)疾病[9]、心血管疾病[10]、慢性肝炎病毒感染[11]、自身免疫性疾病[12,13]、腫瘤[14]等多種疾病中參與炎癥的免疫調(diào)節(jié)。除此之外，IL-35也被發(fā)現(xiàn)在過(guò)敏性疾病如過(guò)敏性哮喘及過(guò)敏性鼻炎的發(fā)病中起重要作用，有學(xué)者[15]研究表明Treg細(xì)胞主要是通過(guò)IL-35抑制Th17細(xì)胞的分化和IL-17因子釋放的方式發(fā)揮作用。Li等建立了Balb/c小鼠過(guò)敏性氣道疾病模型，發(fā)現(xiàn)將腺病毒介導(dǎo)的IL-35基因轉(zhuǎn)入小鼠體內(nèi)能明顯減低氣道高反應(yīng)性、增加肺組織中CD4+CD25+Fox3+T細(xì)胞的數(shù)量并降低支氣管肺泡灌洗液中IL-4、IL-5、IL-13及IL-17的水平[16]。此后，在一些過(guò)敏性鼻炎或哮喘的動(dòng)物模型及患者體內(nèi)進(jìn)行的試驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)了IL-35對(duì)Treg細(xì)胞的上調(diào)作用和對(duì)Th2、Th17細(xì)胞的抑制作用[17,18]。鑒于AD這一皮膚科常見(jiàn)的過(guò)敏性炎性疾病與過(guò)敏性氣道疾病的發(fā)病機(jī)制有相似之處，故我們推測(cè)IL-35亦可能在AD發(fā)病中起負(fù)調(diào)控作用。我們采用了DNFB誘導(dǎo)的特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型對(duì)IL-35在AD發(fā)病中的作用做了初步探討，目前鮮有報(bào)道。

本次實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，在特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型血清中IL-4、IL-17水平明顯高于對(duì)照組，IFN-γ水平較對(duì)照組有所降低，這與特應(yīng)性皮炎急性期Th2細(xì)胞占優(yōu)勢(shì)及Th17促進(jìn)其發(fā)病的理論相符[19,20]；而其血清中IL-35水平較對(duì)照組明顯下降提示Treg免疫抑制功能的減弱。此外，模型組小鼠血清中IL-35與IL-17呈負(fù)相關(guān)，這在一定程度上代表了Th17/Treg比例的失衡，與過(guò)敏性氣道疾病的研究結(jié)果類似，進(jìn)一步證實(shí)了Th17/Treg細(xì)胞失衡是導(dǎo)致過(guò)敏性炎性疾病的重要原因之一。另外，我們的研究還發(fā)現(xiàn)特應(yīng)性皮炎樣小鼠模型皮損中IL-12p35 mRNA與EBI3 mRNA表達(dá)均較對(duì)照組明顯降低，提示IL-35可能在抑制皮損形成方面發(fā)揮作用。Wang等[21]的研究顯示IL-35可能會(huì)抑制活化的CD4+CD25-T細(xì)胞產(chǎn)生IL-4并逆轉(zhuǎn)Th1/Th2的失衡，而我們此次研究并未發(fā)現(xiàn)模型組小鼠血清中IL-35水平與IL-4、IFN-γ水平有相關(guān)性。但由于此次研究樣本量較小，結(jié)果的局限性及偏倚性不可避免，故尚待更大樣本及更深入的人體試驗(yàn)進(jìn)一步進(jìn)行相關(guān)驗(yàn)證。

綜上，該研究提示，IL-35可能參與特應(yīng)性皮炎的發(fā)病，尤其在維持Th17/Treg平衡方面可能發(fā)揮作用，但其靶蛋白的表達(dá)、其對(duì)Th1/Th2的影響及發(fā)揮作用的具體機(jī)制等方面還有待進(jìn)一步研究。