關于濕熱滅菌工藝的微生物驗證討論

杜海

摘 要：本文通過對生物指示劑的選擇、驗證方法等內容來討論濕熱滅菌工藝的微生物驗證。

關鍵詞：濕熱滅菌 驗證

最終產品的無菌質量取決于兩個因素，即滅菌前產品中的微生物含量以及滅菌工藝的殺滅效果。微生物學驗證就是在這兩個因素的基礎上進行的。要用與產品滅菌工藝相適應的最苛刻條件來挑戰該產品滅菌工藝的有效性、可靠性和穩定性。任何滅菌工藝均應當能使產品中的污染菌含量下降至一個菌后，再下降6個對數單位，這樣才能保證產品經滅菌后其中非無菌品的概率不超過1/百萬。

一、熱對微生物細胞的效應：濕熱滅菌的效應是導致細胞內的關鍵性蛋白質和酶發生熱變性或凝固。溫度對該破壞性過程起促進作用。從微觀角度來看，不具備真正核膜結構的原核細胞（如細菌和藍綠藻）最為耐熱。一般說來，微生物的耐熱性可按下列順序排列（耐熱從高到低）：細菌芽孢>酵母菌及霉菌>革蘭陽性細菌>革蘭陰性細菌>病毒。具備核膜結構的真核微生物，在60℃-80℃就可被迅速殺滅。絕大多數細菌的營養細胞在45℃以上就不能生長，80℃-100℃就可被迅速殺滅，但是，某些嗜熱細菌甚至可在80℃以上的高溫中生存。細菌芽孢的耐熱性與很多因素有關，芽孢形成時，細菌停止生化反應，并將遺傳物質包于芽孢內。隨之進行一系列生物物理變化：細胞質大量脫水并體積減小，然后在縮小的原生質體周圍形成一層厚殼。此過程中形成了一種名為吡啶二羧酸或DPA（吡啶-2，6-二羧酸）的特殊化學物質。芽孢形成階段，吡啶二羧酸鈣與DNA以及細胞內的酶形成復合物，以保護處于惡劣環境中的芽孢。芽孢可以在休眠狀態下存活多年，一旦條件利于萌發，便可在幾分鐘內恢復到生長狀態。

二、生物指示劑的選擇 ：

美國藥典對過熱滅菌工藝的定義是指能使D值不小于1分鐘的微生物至少下降12個對數單位的滅菌工藝。對一般的液體產品而言，在121℃滅菌15分鐘即被認為過熱滅菌工藝。但對管路、膠塞、織物以及過濾器等熱穿透性較差的物品則需要更長的滅菌時間或更高的滅菌溫度，方能達到過熱滅菌要求。用做生物指示劑的微生物芽孢應具有良好的耐熱性并且耐熱性也相對比較穩定。

根據滅菌工藝對微生物的強熱至死效應，通常選用D值不低于1.5-3.0分鐘的嗜熱脂肪芽孢桿菌芽孢（每個指示劑的芽孢含量通常在105-107之間）作為生物指示劑對過熱滅菌工藝進行驗證。該類指示劑在F0值低于其存活時間（D值×芽孢數的對數-2）時，應當能全部呈陽性結果；當F0值高于其殺滅時間（D值×芽孢數的對數+4）時，所有的生物指示劑均應呈陰性結果。對F0值為15分鐘的滅菌工藝，可選用D值為1.5分鐘、芽孢含量為106個的生物指示劑，或其他耐熱性相當的生物指示劑，對其進行驗證。

1每單位生物指示劑的芽孢含量1.0×106至5.0×106；

2每單位生物指示劑的芽孢含量1.0×106至5.0×107；

3每單位生物指示劑的芽孢含量1.0×105至5.0×106；

D值指在一定溫度下將微生物數量殺滅90%或下降一個對數單位所需要的時間。

根據被滅菌物品的性質來確認所選用不同包裝方式的生物指示劑。常用于滅菌工藝驗證的生物指示劑主要有三種形式：芽孢條、芽孢懸浮液和自含型安瓿瓶生物指示劑。滅菌溶液時，多選用自含型安瓿瓶生物指示劑；滅菌織物時，多選用芽孢條；滅菌管路時，則可能要選用特殊生物指示劑（如用接有芽孢的鋼絲、線等）以測試死角處（最冷點）的滅菌狀況。對一特定的滅菌工藝而言，盡可能購買同一類型的生物指示劑，這樣可以大大減少實驗室花費在生物指示劑的質量復核及滅菌工藝驗證評價方面的工作量。

三、生物指示劑驗證方法：

驗證時，腔室內的物品應按實際生產時的要求進行裝載，生物指示劑的使用數量應足以反映整個物品內、外部的滅菌狀況，生物指示劑既要遍布整個腔室，又要盡可能的放在熱效應最差的部位，如物品中央、管路拐角以及腔室的排水口等。應盡可能地將生物指示劑與物理測試用溫度探頭放于同一位置，以準確獲取物理參數與微生物致死性之間的相關性資料，這對偏差分析至關重要。

放置在每個位置的生物指示劑均應做好標記，并且要與驗證文件中生物指示劑的驗證分布圖相對應。

驗證時，采用相關產品的最低滅菌條件進行滅菌處理。滅菌程序結束后。將生物指示劑取出并清點數量并確認無誤后，送至微生物室，于適當條件下培養檢查。培養檢查時，需要考慮陽性對照以及培養基的靈敏度等關鍵事項。

當生物指示劑經受挑戰試驗后，宜在4小時內培養（有資料提議）。但是，從質量保證角度來看，我們應當盡可能的在較短時間內培養經受挑戰后的生物指示劑。每個企業應根據自身的條件和特點制定適當的時間限度。

在初始驗證階段，分別用生物指示劑在相同的滅菌條件下至少連續運行3次，以評價滅菌工藝條件的穩定性；在以后的定期再驗證中，每次檢測一批即可。

驗證時的生物指示劑分布、腔室內的產品裝載及指示劑的控制要求均與過熱滅菌工藝驗證時生物指示劑的使用原則相同。

四、結果評價：

在上述驗證條件下，只有連續3次試驗的所有結果均合格（均呈陰性）方可證明相應滅菌工藝的可靠性。

參考文獻：

[1]王彥忠；濕熱滅菌工藝的微生物驗證。2011；08