紫花苜蓿種帶阪崎克羅諾桿菌的分離鑒定及其致病性初步研究

張振粉，蘇靜，楊成德，師尚禮，花立民，WALAA Mohamaden

(1.甘肅農業大學草業學院，甘肅 蘭州 730070；2.草業生態系統教育部重點實驗室，中-美草地畜牧業可持續發展研究中心，甘肅 蘭州 730070；3.甘肅農業大學植物保護學院，甘肅 蘭州 730070)

種帶病原物可通過種子儲存在時間上進行延續，可通過商業、生產和科技交流等活動在空間上進行傳播[1]。而且種子攜帶并傳播病菌既是眾多地區的植物發生新病害的原因，也是導致動物疾病和人類食源性疾病的罪魁禍首[2]。國內外紫花苜蓿(Medicagosativa)種子貿易頻繁，增加了種帶病原細菌的侵入和傳播的風險系數，既限制紫花苜蓿的優質高產[3-5]，還是畜產品安全和人類健康的潛在威脅[2,6-7]。

克羅諾桿菌屬(Cronobacterspp.)是一類重要的食源性致病菌，Iversen等[8]2008年在國際微生物系統分類雜志上提出創立隸屬于腸桿菌科的一個新屬，將阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii)歸入克羅諾桿菌屬，重新命名為阪崎克羅諾桿菌(Cronobactersakazakii)。該菌可引起新生兒急性腦膜炎等疾病，廣泛存在于受污染的嬰兒配方食品、奶粉、干酪食品、牛肉餡、香腸、蔬菜、谷物類、豆腐、草藥和調味料等[9-13]。但是對于非動物及其相關產品來源的阪崎克羅諾桿菌的動物和植物的致病性尚無相關研究。

鑒于紫花苜蓿是肉、奶等動物源性畜產品安全生產的飼料基礎，且直接關系到動物和人類的健康和食物安全。探明不同產地紫花苜蓿種帶阪崎克羅諾桿菌的含量及其對動物與植物的致病性以及了解該菌株的生物學特性具有重要意義。現將紫花苜蓿種帶阪崎克羅諾桿菌的相關研究報道如下，以期為防控其侵入與傳播提供理論基礎和開拓新思路。

1 材料與方法

1.1 供試紫花苜蓿品種、模式動物及細菌菌株

供試紫花苜蓿材料相關信息見表1。試驗于2015-2017年進行。種子樣于5 ℃恒溫保藏。供試標準細菌菌株陰溝腸桿菌(Enterobacercloacae) ACCC 10523購自中國農業微生物菌種保藏管理中心(Agricultural Culture Collection of China, ACCC)，菌株ACCC 10523 分離自人類的脊髓液[5]。

供試動物：潔凈級昆明小白鼠[每只凈重(20±2) g]由蘭州大學動物實驗中心提供。

1.2 培養基的制備

胰蛋白胨大豆瓊脂/液體培養基(tryptose soya agar/broth, TSA/TSB)：配方詳見參考文獻[14]，主要用于紫花苜蓿種帶阪崎克羅諾桿菌疑似分離物的分離培養和純化。

表1 供試紫花苜蓿種子樣本的來源及初始質量Table 1 Origin and initial quality of tested seed samples

1.3 紫花苜蓿種帶細菌分離

采用常規稀釋法分離培養，即分別稱取紫花苜蓿種樣1 g (約450粒)，將種子先用75%的乙醇浸泡2 min，后轉入1%的NaClO消毒5 min[15]，用無菌水沖洗3～4次轉至盛有10 mL無菌水的研缽中研磨后稀釋涂板，涂抹無菌水為空白對照，轉至30 ℃恒溫箱中培養48 h后，挑取疑似分離物純化直至得到純培養物并編號備用。

1.4 分離物對紫花苜蓿的致病性測定

1.4.1前期準備 1)對培養皿和濾紙進行滅菌處理；2)選擇健康飽滿的阿爾岡金紫花苜蓿種子作為供試種樣，對其進行表面消毒[15]；3)制備菌懸液：在250 mL的三角瓶中制備100 mL的TSB，用接種環將已純化的幼齡疑似分離物挑取一環接入培養液中，繼之在搖床中培養大約12 h，取10 mL菌液在離心機5000 r·min-1下離心10 min后棄上清液，加無菌水清洗再離心，重復3次，然后加入10 mL無菌水振蕩混勻后即為菌懸液；4)在滅菌的培養皿(直徑90 mm)中鋪好無菌濾紙；5)將紫花苜蓿種樣用已制備的菌懸液浸泡30 min后備用。

1.4.2皿內發芽侵染 處理組每玻璃培養皿放50粒種子，用無菌水浸泡種樣作為對照組；于(28±1) ℃恒溫培養。5個重復，觀察對照組和處理組種子在培養皿內的生長情況并記錄數據。

1.4.3盆栽侵染 1)每個花盆種植10粒紫花苜蓿種子，溫室條件下澆無菌水，使其健康生長；2)50 d后，進行接種侵染；3)傷口侵染處理組即為用接種針在種苗上人為造成輕微傷口后接種菌懸液，對照組接種無菌水，每個處理各5盆。

1.5 分離物對動物的致病性測定

將已純化的所有菌株制備成菌懸液(≈109cfu·mL-1)，繼之用無菌醫用注射器(1 mL)吸取菌懸液0.1 mL，采取腹腔注射法[16]將0.1 mL菌液注射到潔凈級昆明小白鼠體內(雌雄各半，體重20～25 g)，對照組腹腔注射等量無菌水；處理組與對照組各15只，每5只于籠中飼養。每隔4 h觀察現象并記錄活動情況。

小白鼠器官的取材及制片：于接種后的12 h時間段，在生物安全柜中將試驗鼠斷頭處死，取其腦、心、肝、脾、肺和腎臟組織，并迅速于10%甲醛中固定保存[17]，常溫固定20 d后，脫水、包埋和切片，蘇木精-伊紅 (HE)染色后[18]，于光學顯微鏡及配套圖像拍攝系統(Leica，德國)拍照并分析病理特征。同時，取一定體積的血液，于TSA培養基上涂板分離和純化疑似阪崎克羅諾桿菌分離物，采用生理生化特征和16S rDNA鑒定細菌分離物。

1.6 細菌分離物鑒定

1.6.1生理生化特征 參照文獻[19-20], 對分離自紫花苜蓿的代表菌株1gF3和分離自小鼠血液的菌株TM2進行了革蘭氏染色、需厭氧生長、硝酸鹽還原和利用碳源產酸等生理生化特征測定。

1.6.216S rDNA基因序列分析 種帶細菌16S rDNA基因序列擴增引物為通用引物27 F/1492 R, 由武漢金開瑞生物工程有限公司合成; 擴增和檢測方法等具體參考文獻[21]，與NCBI數據庫(http://www.ncbi.nlm.nih-gov/blast.cgi)中序列進行相似性比較, 并往GenBank上提交序列。

1.7 生物特性測定

參照文獻[22]，對菌株1gF3進行生長曲線、不同溫度、干旱脅迫、耐鹽性、不同酸堿度和光照條件下細菌生長量的測定。

1.8 數據統計

采用SPSS 13.0分析軟件(SPSS Inc., Chicago, IL, USA)分析菌株1gF3的生長曲線、最適濕度、溫度、pH、NaCl和光照條件的OD600值數據，并使用ANOVA進行顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 紫花苜蓿種帶細菌分離

共從6份紫花苜蓿種子上分離得到44株細菌分離物，其中3株疑似阪崎克羅諾桿菌菌株(表2)。而空白對照則未見菌落生長。1aF3占1 g紫花苜蓿種子所含的可培養細菌菌落數量的0.17%，占可培養細菌多樣性的15.90%；1cF3占1 g紫花苜蓿種子所含的可培養細菌菌落數量的0.06%，占可培養細菌多樣性的18.18%；1gF3占1 g紫花苜蓿種子所含的可培養細菌菌落數量的0.80%，占可培養細菌多樣性的11.36%。

表2 紫花苜蓿種帶細菌種群及其數量Table 2 Seed-borne bacteria population and quantity of different varieties lucerne

“-”表示無。“-” indicates nothing.

2.2 紫花苜蓿種帶細菌分離物1gF3的致病性

2.2.1對紫花苜蓿的致病性 紫花苜蓿種帶細菌分離物1gF3的菌懸液浸種后皿內發芽及盆栽傷口接種菌懸液侵染試驗結果表明，為期21 d的皿內發芽試驗侵染組與對照組均表現正常生長未出現發病癥狀(圖1A，B)；為期90 d的菌懸液傷口侵染試驗，侵染組與對照組均表現正常生長未出現發病癥狀(圖1C，D)。

2.2.2對昆明系小白鼠的致病性 細菌分離物1gF3室內腹腔注射菌懸液接種后小鼠出現厭食、離群、發抖等癥狀，部分小鼠在接種24 h后死亡；而接種無菌水的對照組則健康生長，無異樣。接種1gF3菌懸液12 h后各器官病理特征如下：小鼠腦組織中出現巨噬細胞，可引起化膿性腦炎(圖2);小鼠心肌水腫擴張，部分心肌斷裂，炎性細胞輕微浸潤(圖3);小鼠肝小葉邊緣出現部分變性和壞死，靜脈有淤血(圖4);小鼠脾臟紅髓細胞大量減少，局部紅髓中出現大量鐵血黃素巨噬細胞，是急性脾炎的表現(圖5);小鼠肺臟水腫，肺間質增寬，炎性細胞浸潤，氣管大量出血，支氣管上皮脫落，肺部有局灶性出血，屬典型急性彌散性血管內凝血(disseminated intravascular coagulation，DIC)(圖6)；小鼠腎臟腎小球表現出了明顯的病變，屬于典型的腎臟急性DIC(圖7)。腹腔注射無菌水后，小白鼠的心、肝、脾、肺和腎臟器無病變。通過發病小鼠血液涂板分離并純化后得到疑似阪崎克羅諾桿菌菌株TM2，待鑒定。

2.3 紫花苜蓿種帶疑似分離物的鑒定

2.3.1生理生化特征 細菌分離物1gF3、TM2和陰溝腸桿菌標準菌株ACCC 10523的主要生理生化特征詳見表3。結果表明，菌株1gF3、TM2與陰溝腸桿菌標準菌株ACCC 10523表型特征接近，但在產黃色素，苯丙氨酸脫羧酶和精氨酸水解酶及水解尿素特性和利用丙二酸鹽的生理生化指標上與陰溝腸桿菌標準菌株不同，根據表型特征，初步將它們確定為阪崎克羅諾桿菌。

圖1 皿內發芽和盆栽試驗接種細菌分離物1gF3 21 d后對紫花苜蓿的致病性Fig.1 The pathogenicity of bacterial isolate 1gF3 for lucerne after 21 d inoculation in petri dishes germination and pot culture A, C: 細菌分離物1gF3處理組Group treated by bacterial isolate 1gF3; B，D: 無菌水對照組Control.

圖2 1gF3接種小鼠12 h后腦組織病理癥狀Fig.2 The pathological symptoms of brain tissue inoculated with isolate 1gF3 in mice after 12 h A: 方框內箭頭所指為腦組織小膠質細胞團(腦中的巨噬細胞)(10×10 X) Microglia mass (macrophages in the brain) shown in the box with marked arrow (10×10 X); B: 方框內箭頭所指為腦炎癥，化膿性腦炎(10×10 X) Inflammation of the brain, suppurative encephalitis in the box with marked arrow (10×10 X); C: 無菌水注射組腦組織(10×10 X)，左上方框為小腦，右下方框為大腦 The control group of brain tissue injected by sterile water， the upper left box was the cerebellum and the right lower box was the cerebrum (10×10 X).

圖3 1gF3接種小鼠12 h后心臟組織病理癥狀Fig.3 The pathological symptoms of heart tissue inoculated with isolate 1gF3 in mice after 12 h A: 心肌水腫擴張，心壁上血管靜脈有淤血，心肌纖維間隙擴大，局部心肌纖維有斷裂(10×10 X) The myocardial edema dilated, the vascular veins on the wall of the heart had blood stasis, the interventricular fibrosis was enlarged, and the local myocardial fibers were broken shown in the box with marked arrow (10×10 X); B: 注射無菌水組心臟組織(10×10 X) The control group of heart tissue injected by sterile water (10×10 X).

圖4 1gF3接種小鼠12 h后肝臟組織病理癥狀Fig.4 The pathological symptoms of liver tissue inoculated with isolate 1gF3 in mice after 12 h A：中央靜脈有嚴重淤血(方框內所示) (10×10 X) Severe congestion in the central vein shown in the box with marked arrow (10×10 X)；B：肝竇隙擴張 (10×10 X) Dilatation of hepatic sinusoid (10×10 X)；C：肝小葉局部發生脂肪變性，有壞死灶(方框內所示) (10×10 X) Fatty degeneration in the lobule of the liver, with necrotic foci (shown in the box with marked arrow) (10×10 X);D：肝小葉脂肪變性 (10×10 X) Fatty degeneration of hepatic lobule (10×10 X)；E：肝臟病變 (10×10 X) Hepatic lesions (10×10 X)；F：注射無菌水組肝臟組織 (10×10 X)The control group of liver tissue injected by sterile water (10×10 X).

圖5 1gF3接種小鼠12 h后脾臟組織病理癥狀Fig.5 The pathological symptoms of spleen tissue inoculated with isolate 1gF3 in mice after 12 h A～C: 紅髓中細胞大量減少(這是一種紅髓的淋巴細胞大量崩解壞死癥狀)，局部紅髓中大量鐵血黃素巨噬細胞(10×10 X) A large number of cells in the red pulp reduced (a large number of disintegration and necrosis of a red pulp lymphocyte), and a large number of hemoflavin macrophages in the local red pulp (10×10 X); D: 注射無菌水組脾臟組織(10×10 X) The control group of spleen tissue injected by sterile water (10×10 X).

2.3.216S rDNA鑒定 試驗結果表明，菌株1gF3和TM2經PCR擴增16S rDNA，測定的基因大小分別為：1gF3 (1149 bp)和TM2 (1397 bp)，100%相似于克羅諾桿菌屬(Cronobactersp.)，與阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii)相似性達99%，將其初步鑒定為阪崎克羅諾桿菌(C.sakazakii)(表4)。結合生理生化特性和16S rDNA鑒定方法，將細菌分離物1gF3和TM2確定為阪崎克羅諾桿菌。

圖6 1gF3接種小鼠12 h后肺臟組織病理癥狀Fig.6 The pathological symptoms of lung tissue inoculated with isolate 1gF3 in mice after 12 h A: 肺間質增寬，有淤血(10×10 X) The pulmonary interstitium is broadened, with congestion (10×10 X); B: 肺氣腫，肺泡擴張(10×10 X) Emphysema, alveolar dilatation (10×10 X); C: 注射無菌水組肺臟組織(10×10 X) The control group of lung tissue injected by sterile water (10×10 X).

2.4 1gF3的生物學特性

1gF3在0～24 h時處于緩慢生長期，24～36 h時，該菌的生長速度呈對數增長，進入對數生長期，而在36～48 h時，該菌生長速度緩慢下降，并慢慢進入衰亡期(圖8A)。菌株1gF3的生長數量是隨聚乙二醇-6000 (polyethylene glycol-6000, PEG-6000)干旱脅迫濃度的增加而呈線性相關的下降趨勢，當PEG-6000的濃度提高到500 g·L-1時，也就是干旱脅迫最強時，菌株1gF3的生長數量接近0(圖8B)。菌株1gF3能在較寬溫度范圍內生長，在4 ℃下該菌的生長量接近對照，即0；隨著溫度的升高，該菌生長量增加，當達到28 ℃時該菌的生長量達到最大值，也顯著高于其他溫度，該菌在41 ℃條件下生長量急劇下降，但保持了一定的生長量(圖8C)。菌株1gF3能耐受較寬的pH范圍，以pH 7為中軸點呈兩端拋物線下降趨勢，其pH值為7時，該菌的生長量最大，pH 3和11不利于該菌繁殖(圖8D)。菌株1gF3在NaCl濃度為5時生長量最大，顯著高于其他濃度，說明該菌不需鹽生長，隨著NaCl濃度上升該菌的生長量受到抑制(P<0.05)(圖8E)。菌株1gF3在全黑暗生長條件下的生長量達到最高，顯著高于全光照或光暗12 h交替(P<0.05)(圖8F)。

表3 紫花苜蓿種帶細菌分離物1gF3、TM2和購自ACCC的標準菌株的表型特征Table 3 Phenotypic characteristics of bacterial isolates 1gF3 from lucerne seeds, TM2 from the blood of diseased mice and type strain ACCC 10523

+：陽性Positive；-:陰性Negative.

表4 細菌分離物1gF3和TM2的16S rDNA鑒定Table 4 16S rDNA identification of bacterial isolates 1gF3 and TM2

3 討論

3.1 阪崎克羅諾桿菌的環境適應能力

阪崎克羅諾桿菌能存活于極干燥的環境條件[9-10]，對強酸堿、高溫等極端環境具有較強的適應能力[23-25]，所以它一旦進入環境，將很難得到清除。本研究發現阪崎克羅諾桿菌1gF3菌株的抗旱和耐鹽能力突出，這可能得益于該菌細胞內含有大量的海藻糖酶，累積有大量的海藻糖，使得該菌比沙門菌和其他腸桿菌更耐受滲透壓和干燥[24-25]。菌株1gF3在10～41 ℃下都能生長，其他研究發現阪崎克羅諾桿菌能耐受高溫，最高可耐受72 ℃[25]。此外，阪崎克羅諾桿菌細胞壁的主要成分為脂多糖(lipopolysaccharides, LPS)，當細菌崩裂時釋放出來，具有一定的耐熱性，在pH為6時活性最高，可在90 ℃時30 min內保持穩定[26-27]。1gF3菌株的pH生長范圍很寬，能在pH 3～11下生長，研究報道顯示阪崎克羅諾桿菌具有很強的抗酸能力，能在pH 0.9～2.0環境下存活[28]，由于該菌具有形成生物膜的能力，且周生鞭毛容易扎堆生長，這都有助于阪崎克羅諾桿菌對抗強酸或其他不利的生長環境[27]。生物膜含有不同狀態的細胞[29]，平均而言，形成生物膜的細菌比裸露的同伴有一個更高的(高達1000倍)抗生素耐受性[30]。由于阪崎克羅諾桿菌含有LPS和產生生物膜等自身屬性和特點，有利于該菌適應不同的環境條件，從而使其種群得以繁衍生息。

圖8 阪崎克羅諾桿菌1gF3的生物學特性Fig.8 The biological characteristics of C. sakazakii strain 1gF3 誤差棒(±SE)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05) Bars represent mean values (±SE), with differing letters denoting significant difference (P<0.05).

3.2 阪崎克羅諾桿菌的致病性

聯合國糧農組織和世界衛生組織(FAO/WHO)把阪崎克羅諾桿菌列為嬰兒配方奶粉中A 類致病菌，它能引起新生兒腦膜炎、致死性小腸結腸炎以及菌血癥等，可引發嚴重的神經系統后遺癥和發育障礙[31-32]。感染發病主要集中在3天至4歲的新生兒和嬰幼兒，成人也可感染[23]。2004年2月FAO/WHO在日內瓦召開的嬰兒配方奶粉中阪崎腸桿菌(C.sakazakii)專家研討會上提出，嬰兒配方奶粉中微量的阪崎腸桿菌[小于3 cfu·(100 g)-1]就可以導致感染的發生[12,33]。本試驗證實植物源阪崎克羅諾桿菌，即紫花苜蓿種帶阪崎克羅諾桿菌對小白鼠具有致病性。而且紫花苜蓿種帶阪崎克羅諾桿菌1gF3菌株的含量達到>107cfu·(100 g)-1。研究發現大多數人類細菌性病害感染都與其形成生物膜直接相關[34-35]，阪崎腸桿菌可產生生物膜助其免疫逃避，并且通過彌散性粘附或細胞表面局部定殖菌粘附或者兩者混合型粘附的方式定殖腦微血管內皮細胞，然后侵入并誘導細胞凋亡[36]。此外，阪崎克羅諾桿菌還可以產生細菌內毒素即LPS[37]，內毒素是動物產生急性彌散性血管內凝血等癥狀的主要致病因子。本研究通過腹腔注射阪崎克羅諾桿菌1gF3侵染小鼠并造成了心、肝、脾、肺、腎臟組織的彌散性血管凝血，肝臟局部壞死以及化膿性腦炎，其致病機理有待進一步驗證。另外，本試驗僅采用腹腔注射成年小鼠，并未對飼喂等其他入侵方式以及乳鼠等試驗對象做進一步的研究，此為局限之處，特作說明。

2008年馬諾阿夏威夷大學熱帶農業與人力資源學院的Keith等[38]報道了目前唯一一例由阪崎腸桿菌(Enterobactersakazakii) (現阪崎克羅諾桿菌)引起的番木瓜果實非典型中心黃化病。本試驗未發現阪崎克羅諾桿菌對紫花苜蓿具有致病性。

3.3 阪崎克羅諾桿菌在土草畜系統中的生活周期

植物是連接土壤與動物的重要載體之一[2]。植物從土壤中吸收必要的營養，動物取食植物體，又通過尸體或分泌物和排泄物返回土壤，在這物質流通過程中，微生物尤其是細菌貫穿始終[2]。阪崎克羅諾桿菌呈世界分布，可以從很多食品和外環境中分離獲得[39]。近年來許多流行病調查表明阪崎克羅諾桿菌感染和嬰幼兒配方奶粉密切相關[39]。由于阪崎克羅諾桿菌并不是動物和人的正常菌群，因此土壤、水和蔬菜可能是奶粉中的阪崎克羅諾桿菌的最初來源[12]。研究發現細菌可通過土壤、水源和種子等攜帶隨種子萌發進入植物各個組織，最后再回到種子得以保藏及延續[16]。阪崎克羅諾桿菌由于出色的抗逆能力，一旦經土壤和水源等外部環境進入紫花苜蓿種子，將定殖種子內部并受到種皮保護，從而躲避農業生產中的農藥拌種等消毒手段而進入生態系統中。紫花苜蓿常被加工成干草[40]、青貯[41-42]以及草顆粒[43]等產品，是奶牛最優質的牧草飼料之一。奶牛在采食苜蓿飼料的同時，也將阪崎克羅諾桿菌帶入了體內，并寄生于其腸道。世界各地常有紫花苜蓿食源性細菌性疾病發生，如食用帶有腸道沙門氏菌不同血清型：新港沙門氏菌(SalmonellaentericaSerovar Newport)和瘋牛沙門氏菌(S.entericaSerovar Bovismorbificans)，以及大腸埃希氏菌O157:H7(EscbericbiacoliO157:H7)等病原細菌的苜蓿芽而引致的食源性疾病疫情層出不窮[2,7,44]。但是阪崎克羅諾桿菌多感染嬰幼兒，而成年的動物或人類寄生了該菌不發病常不易引起警覺，直至新生兒或嬰幼兒食用污染的奶粉發病后才引起重視。

綜上所述，阪崎克羅諾桿菌可存活于紫花苜蓿種子長達十多年，且對小鼠具有致病性，但對紫花苜蓿不致病。這種可以引起動物致病卻長久寄生于植物材料而躲避動物檢疫的病原細菌更應引起相關部門的高度重視。