從光合作用和有機酸積累角度探索轉GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐堿性增強的生理機制

才華，許慧慧，孫娜，宋婷婷，任永晶，楊圣秋

(東北農業大學生命科學學院，黑龍江 哈爾濱150030)

紫花苜蓿(Medicagosativa)，屬于多年生的豆科植物，其營養價值高、產量高、分布廣，能適應多種環境條件。盡管苜蓿能耐輕微鹽堿，但是高鹽堿地區苜蓿產量顯著減少[1-2]。如能提高輕度鹽堿地苜蓿的產量，將對改善鹽堿土及促進畜牧業的發展具有重大意義。

光合作用對植物的生長及植物對環境的適應起著重要的作用，直接影響著農作物和牧草的生產力及適應性[3]。堿脅迫下光合作用受到抑制較鹽脅迫更為明顯[4-7]，堿脅迫不僅僅會使植物遭受離子毒害和滲透脅迫，同時較高水平的pH會造成植物根圍的營養元素離子沉淀，進而使它們的可利用性降低，這些離子包括Ca2+、Mg2+、Cl-、 H2PO4-、Fe3+[8-10]，其中Mg2+是構成葉綠素的成分。植物除了可以通過代謝物質的合成來適應鹽堿脅迫外，還能通過改變其自身的代謝途徑提高光合效率而適應高鹽分的環境[11-12]。有些植物如冰葉日中花(Mesembryanthemumcrystallinum)受到干旱或鹽堿脅迫時，能夠改變它們的光合作用模式，從C3模式轉換到景天酸代謝(crassulacean acid metabolism,CAM)[13]。在大多數耐鹽植物中許多物種都顯示出C4型光合作用[14]。C4植物與C3植物相比有更低光呼吸、較高的光合能力、水分和氮素利用效率以及較高的生物產量，并且更適合在炎熱干燥的環境下生存[15-16]。在植物中，操縱磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)水平已成改善植物光合效率的一種手段，研究者也嘗試著將C4途徑的關鍵酶基因轉入C3植物，以期通過提高植物的光合效率來增強植物的適應性[17-19]。Zhang等[20]研究表明在實際干旱條件下，轉玉米C4-PEPC基因的水稻株系能夠穩產與有較高的光合速率相關。Qin等[19]研究表明轉玉米C4-PEPC基因的小麥株系在脅迫期間光合能力提高。因此，光合作用的增強對于提高植物的耐逆性具有重要的意義。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶激酶(phosphoenolpyruvate carboxylase kinase，PPCK)是一個約31 kDa鈣不依賴的絲氨酸/蘇氨酸(Ser/Thr)類蛋白激酶，能夠使磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(phosphoenolpyruvate carboxylase, PEPC)磷酸化[21-22]。PEPC在高等植物多個代謝過程中起著非常重要的作用。PEPC有兩種功能形式，即光合型和非光合亞型。PEPC不僅是C4和CAM途徑中催化CO2初級固定的第一個酶，而且 PEPC在C3植物的非光合組織中也起著廣泛的作用，包括參與生物合成前體的供應，通過回補C4-二羧酸用于能量及合成代謝，氮同化過程中對pH的調控及信號級聯反應[23-25]。C4光合作用的酶不僅對植物正常生長有著重要的作用，而且在響應脅迫方面也是非常重要的[26]。在有毒金屬脅迫時，根中較高的PEPC活性可以導致有機酸的合成，如分泌蘋果酸、檸檬酸來酸化土壤，螯合金屬毒離子[27]。PEPC的活性通過PPCK的磷酸化催化控制[28]。同時，多個研究表明PPCK基因響應多種非生物脅迫。在干旱處理下，轉玉米C4-PEPC基因的水稻株系中的PPCK的酶活及轉錄水平(PPCK1、PPCK2)增加，并且PPCK對C4-PEPC啟動子的甲基化及磷酸化催化作用賦予了轉基因水稻耐旱性[29]。Monreal等[14]研究表明，鹽和堿脅迫增加了PEPC和PPCK的活性并且增加了PPCK的表達及蛋白含量。

前期研究發現，超量表達野生大豆(Glycinesoja)來源的GsPPCK1和GsPPCK3基因可有效地提高轉基因苜蓿的耐堿性[30]。本研究將在此基礎上，從光合作用和有機酸積累角度探索轉GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐堿性增強的生理機制，進一步明確GsPPCKs基因在植物耐堿反應中的功能。

1 材料與方法

1.1 植物材料

非轉基因對照龍牧806苜蓿(MedicagosativaLONGMU 806)，黑龍江省農科院草業所購買。轉GsPPCK1、GsPPCK3基因龍牧806苜蓿由實驗室保存[30]，以龍牧806苜蓿子葉節為受體，采用農桿菌介導的遺傳轉化方法獲得轉基因植株。

1.2 NaHCO3處理及取材

試驗于2016年9月-2017年3月進行。每個營養缽中定植一個單株(扦插后30日齡)，營養缽的基質為蛭石∶草炭土=1∶1。挑選長勢一致的植株進行脅迫處理。分成2組，即堿處理組和對照組。每組每個株系(包括非轉基因對照，轉GsPPCK1基因株系P1-5、P1-9，轉GsPPCK3基因株系P3-1、P3-8)各5個單株于一托盤中，重復3次。用200 mmol·L-1NaHCO3進行脅迫處理。堿處理組，即每個托盤一次性加1 L堿脅迫液，每天補加100 mL水于托盤中，pH 值約8.5。對照組則一次性加1 L 水，每天補加100 mL水于托盤中。

分別在未處理、處理1、3、6、9 d時，通過無損傷的方式進行葉綠素含量測定和光合指標測定。在堿脅迫處理9 d時，在10:00-14:00，隨機選取苜蓿葉片，液氮保存，用于有機酸含量和光合酶活的測定。堿處理15 d后，觀察植株的表型。

1.3 光合生理指標的測定

采用便攜式葉綠素測定儀(SPAD-502，廣州滬瑞明儀器有限公司生產)，測定葉綠素相對含量。同時，選擇晴朗無風的天氣于上午9:30-11:00(27～30 ℃，光照度8500～10000 lx)，采用光合測定儀LCi(Li-6400, Li-Cor Inc, USA)測定轉基因苜蓿和非轉基因對照共5個株系的凈光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)和胞間CO2濃度(Ci)，每個葉片重復測定3次，測定10～15個葉片。

1.4 光合途徑關鍵酶活性的測定

1.4.1酶液的制備 取苜蓿葉片10 mg加2 mL研磨緩沖液[1000 μL 50 mmol·L-1Tris-HCl (pH 7.5)；200 μL 50 mmol·L-1MgCl2；500 μL 10 mmol·L-1DTT；2% PVP；10%甘油]，用全自動樣本快速研磨儀(Tissuelyser-24, 上海凈信實業發展有限公司)充分研磨，于12000 r·min-1，4 ℃離心10 min，取上清液定容至2 mL，用于測定NADP-蘋果酸脫氫酶(NADP-malate dehydrogenase, NADP-MDH)、NADP-蘋果酸酶(NADP-malic enzyme, NADP-ME)、磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPC)、丙酮酸正磷酸二激酶(pyruvate orthophosphate dikinase, PPDK)、核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ribulose1,5 bisphosphate carboxylase, Rubisco)的活性。

1.4.2酶活測定 PEPC酶活性的測定參考Sarwat等[31]的方法。參考Johnson等[32]的方法，測定NADP-MDH酶活性。NADP-ME酶活的測定參照Sadka等[33]的方法。Rubisco酶活性的測定參考Gerard等[34]的方法。測量PPDK的酶活性時，參考Sayre等[35]的方法。各株系樣品，測定10個生物學重復。

1.5 有機酸含量的測定

采用高效液相色譜法測定葉片中有機酸含量。使用的儀器包括，Agilent 1100 液相色譜儀，G1314紫外檢測器，G1311A四元泵，G1329B自動進樣器，G1316A柱溫箱，迪馬公司色譜柱Diamonsil C18(250.0 mm×4.6 mm, 5 μm)。具體方法如下：配制標準品，將草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸稀釋成1 mg·mL-1，作為標準儲備液，根據實驗需要，將上述草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸、蘋果酸、檸檬酸儲備液按1∶1∶1∶1的體積比混合，并稀釋成所需質量濃度混合標準溶液。甲醇-0.01 mol·L-1K2HPO4(3∶97)溶液，用磷酸調節pH值至2.0。流速為0.5 mL·min-1，進樣量10 μL，檢測波長210 nm，柱溫25 ℃，使用前用0.45 μm濾膜過濾，超聲脫氣。樣品從-80 ℃取出，液氮研磨成粉狀，準確稱取1 g于離心管中，加入10 mL的超純水，75 ℃水浴提取15 min，使有機酸充分浸出，冷卻后 10000 r·min-1離心30 min，上清液轉移到100 mL容量瓶中，用超純水定容。待測液用0.22 μm 濾膜過濾，將濾液置于2 mL 的進樣瓶中用于色譜測定。

1.6 基因表達差異分析

用含200 mmol·L-1NaHCO3的1/2 Hogland營養液，脅迫轉基因苜蓿和非轉基因苜蓿，按0、1、3、6、12 h取葉片，迅速放入液氮中，存入-80 ℃冰箱保存。采用Real-time-PCR方法測定堿脅迫處理后基因的表達變化。根據蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)對應的基因序列，借助Primer-BLAST(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast)在線工具設計引物，序列信息如表1所示。采用比較CT法(ΔΔCT)以GAPDH為內參基因，以未經處理的樣品作為參照因子。以GAPDH基因為內參基因均一化處理后，通過2-ΔΔCT方法計算；每個基因作3次生物學重復，3次技術重復，數據取3次重復的平均值。原始數據經標準化處理，如果有一個數值的偏差比較大則取兩個數據的平均值。標準化處理后的數據經T-test進行差異顯著性分析。

相對表達量=2-ΔΔCT=2-(ΔCT處理-ΔCT對照)=2-[(CT處理-CT內參)-(CT對照-CT內參)]

表1 用于基因表達分析的各基因引物序列信息Table 1 The information of primers for gene expression analysis

1.7 數據處理

采用Microsoft Excel 2007中標準差、方差分析和T-檢驗等函數進行統計分析轉基因各株系的生理生化指標、基因表達變化與未轉基因對照的差異，其中P<0.01表示兩者差異極顯著，0.010.05表示兩者差異不顯著。

2 結果與分析

2.1 轉基因苜蓿堿脅迫后的表型及葉綠素相對含量的變化

200 mmol·L-1NaHCO3堿脅迫處理15 d后，植株的生長受到抑制，非轉基因植株葉片萎蔫，莖稈干枯，爛根嚴重，趨于死亡。轉基因4個株系葉片雖也有萎蔫，根系僅部分腐爛，仍能持續生長(圖1) ，其中轉基因苜蓿P1-5和P3-8兩個株系較非轉基因苜蓿具有較為明顯的耐堿性。葉綠素相對含量的測定顯示(圖2)，在正常條件下，轉基因株系與非轉基因株系葉綠素相對含量沒有差異。經200 mmol·L-1NaHCO3脅迫處理后，非轉基因株系和轉基因各株系的葉綠素相對含量隨脅迫天數增加均呈下降趨勢(圖2)。堿脅迫6 d， 所有株系葉綠素含量都有所下降，但P1-5、P3-8株系的葉綠素相對含量顯著高于非轉基因株系，達到極顯著水平。堿脅迫9 d，各株系葉綠素含量降到最低，非轉基因株系的相對葉綠素含量顯著低于P1-5和P3-8，達到極顯著水平(P<0.01)，略低于P1-9和P3-1(P<0.05)。P1-5，P3-8株系的葉綠素相對含量與未處理相比變化并不顯著，分別下降了11.27%、13.30%，但非轉基因株系的葉綠素含量變化極為明顯，下降了39.11%。由此可見，堿脅迫處理后，對照植株葉綠素含量明顯下降，而轉GsPPCK1、GsPPCK3基因苜蓿葉綠素含量的變化并不十分明顯，但轉基因各株系耐堿性存在差異。

圖1 轉基因苜蓿和非轉基因苜蓿在200 mmol·L-1 NaHCO3脅迫處理15 d后的表型 Fig.1 Phenotype of the transgenic alfalfa and non transgenic alfalfa under 200 mmol·L-1 NaHCO3 stress after 15 days LM:非轉基因苜蓿龍牧806；P1-5，P1-9：轉GsPPCK1基因苜蓿株系；P3-1，P3-8：轉GsPPCK3基因苜蓿株系。LM: Non-transgenic alfalfa LONGMU806; P1-5, P1-9: The transgenic samples with GsPPCK1; P3-1, P3-8: The transgenic samples with GsPPCK3.下同The same below.

2.2 堿脅迫下葉片光合參數的測定

圖2 200 mmol·L-1 NaHCO3處理下轉基因苜蓿和非轉基因苜蓿葉綠素相對含量的變化Fig.2 Changes in chlorophyll relative content of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa under 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment 利用T-test進行差異顯著性分析，**代表P<0.01 ，*代表0.01

測定的光合作用參數顯示，在未經脅迫處理時，轉基因苜蓿和非轉基因苜蓿各光合作用參數并沒有明顯差異。隨著堿脅迫時間的延長，光合參數均呈先上升后下降的趨勢，并且在處理3 d后，各參數值開始下降(圖3)。從非轉基因的植株光合參數的變化可以看出，在堿脅迫處理初期，各光合指標呈上升趨勢，說明光合作用參與到堿脅迫應答反應中，并起到積極作用。但是隨著處理時間的延長，堿脅迫又嚴重影響了苜蓿的光合作用，光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)均明顯低于脅迫處理前，非轉基因苜蓿各光合參數下降幅度分別為34.55%、32.50%、33.40%及9.99%。轉GsPPCK1、GsPPCK3基因苜蓿各株系的光合作用參數在堿脅迫3 d后也有所下降，但是較未處理差異不顯著，以上4個參數指標下降(與未處理相比)的平均值分別為14.65%、15.71%、15.72%及5.90%。由此表明，轉基因苜蓿的光合作用受堿脅迫的影響較小。GsPPCK1、GsPPCK3基因的超量表達緩解了堿脅迫對光合作用的影響，這一過程可能與PEPC酶的激活有關，與葉綠素含量變化的數據相一致。

圖3 200 mmol·L-1 NaHCO3處理下轉基因苜蓿和非轉基因苜蓿葉片光合速率(Pn)、蒸騰速率(Tr)、氣孔導度(Gs)及胞間CO2濃度(Ci)的變化Fig.3 Changes of photosynthetic rate (Pn), transpiration rate (Tr), stomatal conductance (Gs) and intercellular CO2concentration (Ci) of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa leaves under 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment

2.3 堿脅迫下葉片光合關鍵酶酶活的變化

測定了光合關鍵酶NADP-MDH(NADP-蘋果酸脫氫酶)、NADP-ME(NADP-蘋果酸酶)、PEPC(磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶)、PPDK(丙酮酸正磷酸二激酶)、Rubisco(核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶)的酶活(圖4)。堿脅迫處理9 d以上,各光合關鍵酶酶活性均上調，但轉基因各株系上調的幅度明顯高于非轉基因對照(LM)，并且P1-5和P3-8兩個株系5個酶活指標與對照均有極顯著差異(P<0.01)。由此表明，光合途徑中酶活性的提高，在植物對抗堿脅迫反應中起到積極作用[11-12]。另外，在正常情況下，轉基因苜蓿P1-5和P3-8株系的NADP-MDH、PEPC、PPDK酶的活性顯著高于對照(LM)(0.01

2.4 堿脅迫處理后光合途徑中有機酸含量的變化

按照最佳試驗條件對混合有機酸標準溶液進樣分析，在10 min內實現了5種有機酸基線的分離，各有機酸回歸方程的線性相關系數為0.9992～1.0000，表明線性關系良好。幾種有機酸完全分離，分離效果較好。利用標準品的色譜條件，測定樣品中各有機酸的含量(圖5)。

在未處理情況下，非轉基因對照(LM)和轉基因各株系4種有機酸的含量并未存在顯著差異，堿脅迫處理后，4種有機酸的含量均上升。由此表明，有機酸含量的上升，是苜蓿自身耐堿的生理響應。有機酸作為pH值調節劑，對于緩解堿脅迫對細胞的傷害起到一定的積極作用。轉基因苜蓿4個株系OAA、PEP、檸檬酸、蘋果酸上升的幅度比較大，較未處理上升2.64、2.43、2.11和1.75倍，而對照4種有機酸含量上升的倍數分別為1.89、2.02、1.76和1.71倍。堿脅迫9 d后，轉基因株系P1-5、P3-8的4種有機酸含量與非轉基因對照相比差異極顯著(P<0.01)，而轉基因株系P1-9、P3-1與非轉基因對照相比差異顯著(0.01

圖4 200 mmol·L-1NaHCO3處理9 d后轉基因苜蓿和非轉基因苜蓿葉片酶活性的變化Fig.4 Changes of NADP-MDH, NADP-ME, PEPC, PPDK and Rubisco protease activities in leaves of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa after 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment for 9 days

圖5 200 mmol· L-1NaHCO3處理9 d后轉基因苜蓿和非轉基因苜蓿葉片有機酸含量的變化Fig.5 Changes of oxaloacetic acid (OAA), malic acid, phosphoenolpyruvate (PEP) and citric acid in leaves of transgenic alfalfa and non-transgenic alfalfa after 200 mmol·L-1NaHCO3 treatment for 9 days

2.5 堿脅迫處理后光合途徑相關基因的表達變化

測定光合途徑酶活的同時，檢測了光合途徑關鍵酶對應基因在堿脅迫后表達的差異(圖6)。堿脅迫處理12 h內，5個基因在轉基因株系和非轉基因對照株系中表達變化均呈先上升后下降的趨勢，但在轉基因株系P1-5和P3-8中基因表達的變化顯著高于非轉基因株系。由此表明，在堿脅迫處理后，參與光合作用的相關基因被誘導上調表達，響應堿脅迫。結合酶活性和酶反應的產物有機酸含量看，這些基因的差異表達對于響應堿脅迫起到積極的作用。GsPPCK1和GsPPCK3基因的超量表達，能夠更有效地啟動轉基因苜蓿堿脅迫應答反應，從而提高光合途徑中相應酶的活性，對轉基因苜蓿應答堿脅迫起到正向調控作用。

圖6 200 mmol·L-1 NaHCO3處理12 h內轉基因株系和非轉基因株系葉中PEPC、NADP-MDH、NADP-ME、PPDK和Rubisco基因表達差異Fig.6 Differences in expression of PEPC, NADP-MDH, NADP-ME, PPDK and Rubisco genes in transgenic and non-transgenic lines during 12 h with 200 mmol·L-1 NaHCO3 treatment

3 討論

C3植物的C3循環是在單細胞中完成的，大氣中的CO2直接通過Rubisco催化的羧化反應進入Calvin循環，而C4循環是在葉肉細胞和維管束鞘細胞中協同完成。由于PEPC對其底物CO2有較高的親和力，所以C4植物固定CO2的能力遠大于C3植物。基于C4植物光合作用的高效性及轉基因技術的成熟，已有大量研究試圖將C4植物光合作用關鍵酶轉化C3植物，以期在C3中建立起一個類似于C4循環的光合途徑，以提高光合效率[36]并增強抗逆能力[18-19]。Suzuki等[37]將來源于C4植物類黍尾稃草(Urochloapanicoides)的PEPCK基因轉化水稻，水稻葉綠素含量增加，通過碳同位素標記顯示植物細胞質中PEP含量增加，并形成PEP流從轉化植株的葉綠體中運出。但是轉基因水稻的光合效率并未發生改變，這可能由于導入的PEPCK不能與水稻內源PEPC協同作用以形成有效的C4循環所致[37]。本研究將C3植物野生大豆來源的PPCK1和PPCK3基因轉入苜蓿，在堿脅迫下，轉基因苜蓿葉綠素含量明顯高于對照，光合效率相關參數證明轉基因苜蓿的光合效率明顯高于對照。測定了碳同化過程中的關鍵酶活性也都明顯高于對照，并且PEPC、NADP-MDH、NADP-ME、PPDK和Rubisco基因表達變化也有較對照明顯的變化。這些研究結果表明，C3植物野生大豆來源的GsPPCK1和GsPPCK3可與苜蓿PEPC協同作用，增強轉基因苜蓿的光合效率，從而緩解堿脅迫對苜蓿的損傷。

植物在遭受堿脅迫時，本身可以通過有機酸積累來穩定細胞內pH，這是植物調節細胞內環境適應堿脅迫的一種特殊方式[38]。楊國會[39]報道小冰麥可能通過積累有機酸來彌補負電荷不足，以保持細胞內pH穩定。郭立泉等[40]模擬0～200 mmol·L-1的鹽脅迫和堿脅迫條件處理星星草(Puccinelliatenuiflora)幼苗，發現星星草體內大量積累以檸檬酸為主的有機酸是抗鹽堿植物星星草對堿脅迫的關鍵生理響應。楊春武等[41]模擬不同強度的鹽、堿脅迫條件，對小冰麥苗進行12 d脅迫處理，測定莖葉組織液的pH和有機酸等溶質的濃度，結果表明，有機酸積累是小冰麥在堿脅迫下保持體內離子平衡和pH穩定的關鍵生理響應。PEPC除了固定CO2，還可以在通過羧化的同時減少細胞中HCO3-的含量，從而平衡pH值。另外，在碳固定的循環中，有機酸的產生也會緩解細胞質中的pH值。研究中也發現，轉GsPPCK1/GsPPCK3基因紫花苜蓿葉片的有機酸含量，包括草酰乙酸、磷酸烯醇式丙酮酸、檸檬酸、蘋果酸的含量相對于對照株系都顯著增加。

4 結論

GsPPCK1和GsPPCK3基因在苜蓿中的超量表達，轉基因苜蓿的光合作用受堿脅迫的抑制較??；在光合碳固定的過程中有機酸含量的增加對緩解高pH起到促進作用。光合效率的增強、有機酸積累的協同作用是轉GsPPCK1和GsPPCK3基因苜蓿耐堿性增強的主要原因。