自擬黃芪葛根湯治療實驗性自身免疫性重癥肌無力大鼠的免疫機制研究*

錢立鋒 姚 青 王曉燕 左 瑞

1 浙江省嘉興市中醫醫院 浙江 嘉興 314001 2 陜西省西安市中醫醫院 陜西 西安 710021

目前，現代醫學治療重癥肌無力（MG）大多只能控制癥狀，且療效報道不一，該病缺乏徹底根治的療法,病情嚴重時危及生命。筆者通過動物實驗試從免疫學指標初步探索其內在的免疫調節機制，以期為中醫藥治療MG的有效性提供客觀的依據。現報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物：SPF三級8周齡Lewis大鼠50只，雌性，體重171～185g，實驗動物編號：012，由西安交通大學動物實驗室提供。飼養在SPF級動物實驗室內喂養無菌水和標準無菌顆粒飼料，所有大鼠毛色光滑潤澤，足底紅潤，反應敏捷。

1.2 實驗試劑及藥物：鼠源性AChR-α亞基97-116肽段序列，純度：98.26%，規格：5mg/支，由武漢星皓醫藥公司提供；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、磷酸緩沖液（PBS）由德國SIGMA公司提供；阿托品注射液（東北制藥集團）；新斯的明注射液（上海信誼藥廠）；強的松片（浙江仙琚制藥有限公司）；Rat AChR-Ab、IL-6 ELISA 試劑盒（上海UNIV-Bio科技公司）；自擬黃芪葛根湯(生黃芪、葛根、桂枝、赤芍、炒白術、茯苓、山萸肉、紅參、補骨脂、生姜、大棗、生甘草)濃縮液（西安市中醫醫院提供）。

1.3 實驗方法：分述如下。

1.3.1 實驗造模：采用目前國內外常用的主動免疫造模法，參考許文華等[1]的R97-116復制 EAMG實驗動物模型的方法，第一次免疫：取R97116、CFA、PBS三者充分混勻配制的免疫乳劑200μl（含R97-116：100μg）于大鼠足墊、腹部、背部進行皮下注射，取等量PBS液對正常組進行相同處理；第30天及第45天進行強化接種免疫，取提前配制的加強免疫乳劑200μl（含R97-116：50μg）進行強化免疫，正常組皮下注射等量PBS。

1.3.2 EAMG模型評估及納入標準：通過測量肌力和新斯的明試驗來觀察造模后情況。①測量肌力（即讓大鼠反復抓握籠頂30s后再測量）：采用Lennon評分標準予以肌無力癥狀評分。具體評分標準：0分：正常肌力，無異常；1分：出現輕度的活動減少，大鼠撕咬抓取力量減弱，極易疲勞；2分：大鼠的活動較前明顯減少，體重逐漸減輕，身體成拱起的姿勢，頭和尾出現下垂，雙前肢彎曲，行走不平穩伴震顫；3分：大鼠出現嚴重的全身無力，抓取、撕咬動作消失，身體震顫，臨死表現；4分：大鼠死亡。癥狀介于2個級別之間者，可以計為0.5、1.5、2.5和3.5分。②新斯的明實驗：造模后的大鼠經腹腔注射新斯的明（37.5μg/kg）和硫酸阿托品（15μg/kg），觀察12min后大鼠肌無力癥狀若能緩解并且持續2～12h，可以判定為新斯的明試驗結果為陽性。納入標準：滿足Lennon評分≥1分為肌無力陽性，同時經新斯的明試驗結果為陽性者納入。

1.3.3 實驗分組與給藥：選取50只健康SPF級8周齡的雌性Lewis大鼠，隨機選取8只設為正常組，剩下的進行EAMG造模，將成模的32只EAMG大鼠隨機分為模型組，陽性藥物組，自擬黃芪葛根湯組。根據動物與人藥物劑量的換算公式，按王曉燕教授臨床治療中黃芪常用日劑量180g換算，自擬黃芪葛根湯組給予含黃芪量為16.2mg·kg-1·d-1的自擬黃芪葛根湯灌胃，陽性藥物組給予強的松5.4mg·kg-1·d-1灌胃，正常組同模型組給予等量的生理鹽水灌胃。

1.3.4 檢測指標：治療4周后，①采用Lennon評分標準評估各組大鼠肌無力癥狀；②禁食12h后采用腹主動脈取血法抽取標本2ml，于常溫下靜置30min后，以3000轉/分的轉速離心10min后仔細提取上部透亮清液，采用ELISA法測定各組大鼠血清中的AChRab、IL-6的含量。

1.4 統計學方法：采用SPSS20.0統計軟件進行數據分析。實驗數據用 來表示。符合正態分布且方差齊性的條件下采用單因素方差分析，否則采用近似穩健的方差分析或Kruskal-Wallis檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠Lennon評分比較：見表1。

表1 各組大鼠Lennon評分比較（±s，分）

表1 各組大鼠Lennon評分比較（±s，分）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05。

治療4周后組別 例數 造模后0.00±0.00 1.87±0.35 0.94±0.32★0.44±0.18★正常組模型組陽性藥物組自擬黃芪葛根湯組8 8 8 8 0.00±0.00 1.81±0.46△1.75±0.38△1.81±0.37△

2.2 治療后各組大鼠血清AChRab含量的比較：表2。

表2 治療后各組血清AChRab含量比較（±s）

表2 治療后各組血清AChRab含量比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05；與自擬黃芪葛根湯組比較，●P＜0.05。

AChRab（ng/ml）組別 例數0.85±0.10 7.70±0.70△3.81±0.33★●4.69±0.50★正常組模型組陽性藥物組自擬黃芪葛根湯組8 8 8 8

2.3 治療后各組大鼠血清IL-6含量比較：見表3。

表3 治療后各組血清中IL-6含量比較（±s）

表3 治療后各組血清中IL-6含量比較（±s）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，★P＜0.05；與正常組比較，*P＜0.05。

IL-6（pg/ml）42.40±6.82 77.88±7.41△29.74±3.54★*45.21±6.63★●組別正常組模型組陽性藥物組自擬黃芪葛根湯組例數8 8 8 8

3 討論

重癥肌無力可歸屬于中醫學中“痿證”范疇，由內傷、外感及多種因素引起。課題組王曉燕教授通過對MG患者的長期觀察，從氣的生理功能進行分析認為，先天稟賦不足或病后失調損傷正氣、勞逸過度、長期熬夜等因素均可導致腎陽不足、元氣虧虛。提出了以“益氣升提，培元固本”的治療原則，選用自擬黃芪葛根湯臨證加減。方中黃芪為君藥，尤擅長于益脾氣；本方中黃芪重劑使用，文獻研究[2]發現黃芪一直有大量使用的情況，既補氣又能升氣，從而達到升陽舉陷的效果。現代藥理實驗[3-4]證實黃芪能夠雙向調節紊亂的人體免疫系統；對干擾素系統有促進作用；加速B細胞成熟和漿細胞抗體合成，對T細胞和B淋巴細胞具有明顯的免疫增強作用，提高細胞和體液免疫能力；其所含的多糖類物質能夠平衡淋巴細胞各個亞群的比例和正常抗體的生成，從而增強其免疫平衡作用。葛根，能夠升陽發表、鼓舞脾胃之氣而達到生津液、起陰氣、載藥上行的目的，同時還能夠制約大劑量黃芪的溫燥之性。桂枝、赤芍、茯苓、炒白術起益氣健脾、調和脾胃之效；山萸肉味酸性澀，入足厥陰肝經，使補中有固；再加之紅參、補骨脂能益氣固腎，腎氣足而陽氣旺，腎堅固而氣不散。生姜、大棗固護脾胃、益氣生津；甘草調和藥性。諸藥合用，能使中焦健運而運化無窮，氣機升降有序而氣血和暢，共奏健脾補中、益氣升提，溫腎中之寒水、榮機體之四末的功效。