類風濕關節炎不同中醫證型外周血Th17/Treg細胞表達特點研究*

王曉慧 潘文萍 孫素平 王冉悅 張 勝

1 山東中醫藥大學 山東 濟南 250011 2 山東省千佛山醫院 山東 濟南 250014 3 山東中醫藥大學附屬醫院 山東 濟南 250011

類風濕關節炎（RA）是以侵襲性滑膜炎為特點的一種自身免疫病。Th17細胞是近幾年被發現的一種新型T細胞亞群，Th17/Treg細胞的失衡對于RA的發病至關重要。本文從Th17/Treg細胞等細胞免疫學角度入手，旨在為類風濕關節炎中醫辨證分型提供更多參考依據。

1 資料和方法

1.1 一般資料：RA病人來自于2016年12月～2017年12月在山東中醫藥大學附屬醫院風濕病科住院患者，共117例，男：女比例為1：4.57。濕熱痹阻證54例，占46.15%；寒濕痹阻證14例，占11.97%；痰瘀痹阻證26例，占22.22%，肝腎虧虛證23例，占19.66%。RA患者最小29歲，最大75歲；平均年齡57.61±11.38歲，平均病程9.52±7.96年，四種證型在性別和年齡差異上無統計學意義（P＞0.05）。健康對照組來于本院查體中心性別和年齡匹配的健康人群，年齡在18～55歲，平均年齡47.90±9.74歲。

1.2 診斷標準：西醫診斷標準參照2009年ACR/EULAR對RA的分類標準[1]，中醫診斷標準參照《中藥新藥臨床研究指導原則》[2]辨證分為濕熱痹阻證、寒濕痹阻證、痰瘀痹阻證、肝腎虧虛證四種證型。由2名中級職稱以上的醫師指導辨證分型。

1.3 檢測指標：①Th17細胞：抽取納入人員晨起空腹血3～4ml于肝素管內，取新鮮抗凝全血200μl于EP管中，加入RPMI-1640培養基等體積混勻，依次加入新鮮配置的刺激液（PMA工作液50μl，離子霉素工作液20μl，莫能霉素工作液20μl），混勻，打孔，放入37℃，5%CO2孵箱中孵育4小時。孵育完成后取出混勻，取樣本150μl加入流式細胞管內，加入PE-Cy5-CD4單克隆抗體，室溫避光進行細胞表面染色15min。加入細胞破膜固定劑避光孵育15min，用PBS溶液洗滌2遍，加入FITC-IFN-γ抗體、PE-IL-17抗體、APC-IL-22抗體避光進行細胞內染色，孵育完成洗滌后制成細胞懸液，進行流式細胞學上機檢測。②Treg細胞：取新鮮抗凝全血200μl于流式管中，加入FITC-CD4、PE-Cy5-CD25抗體進行表面染色，孵育20min后加入破膜固定劑，避光孵育60min，再加入破膜緩沖液，加入APC-Foxp3抗體4°（或室溫）避光孵育30min，孵育完成洗滌后制成細胞懸液，進行流式細胞學上機檢測。③臨床及實驗室指標：臨床指標包括DAS-28（28個關節的疾病活動分數）評分，疼痛VAS評分（0～100分），關節腫脹數，關節壓痛數；實驗室指標包括血沉（ESR），C反應蛋白（CRP），類風濕因子（RF），抗環瓜氨酸多肽（CCP）抗體。

1.4 統計學方法：采用SPSS20.0統計軟件分析，計量資料以±s表示，計數資料采用卡方檢驗；樣本資料符合正態分布用t檢驗，不符合正態分布用秩和檢驗。P＜0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組Th17/Treg細胞表達情況比較：見表1。

表1 兩組Th17/Treg細胞表達情況比較（±s）

表1 兩組Th17/Treg細胞表達情況比較（±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.05。

組別RA病人組健康對照組Th17細胞（%）2.30±0.75*1.16±0.16例數117 20 Treg細胞（%）2.32±0.94*4.01±0.99

2.2 不同證型RA病人Th17/Treg細胞表達情況：見表2。

表2 不同證型RA病人Th17/Treg細胞表達情況（±s）

表2 不同證型RA病人Th17/Treg細胞表達情況（±s）

注：與健康對照組比較，*P＜0.05。

證型濕熱痹阻證寒濕痹阻證痰瘀痹阻證肝腎虧虛證健康對照組Th17細胞（%）2.88±0.66*1.61±0.32*1.92±0.40*1.77±0.23*1.16±0.16 Treg細胞（%）1.82±0.83*3.25±1.01*2.14±0.39*3.15±0.56*4.01±0.99

2.3 不同證型RA病人DAS28評分構成比情況比較：見表3。

2.4 不同證型RA病人臨床及實驗室指標分布情況比較：見表4。

表3 不同證型RA病人DAS28評分構成比情況比較[例（%）]

表4 不同證型RA病人臨床及實驗室指標分布情況比較（±s）

表4 不同證型RA病人臨床及實驗室指標分布情況比較（±s）

注：與肝腎虧虛證比較，*P＜0.05。

證型濕熱痹阻證寒濕痹阻證痰瘀痹阻證肝腎虧虛證抗CCP抗體455.19±556.03 462.60±360.24 477.20±543.89 443.58±568.42 VAS（100mm）65.28±10.88*61.79±9.12*64.81±7.94*53.26±6.14關節腫脹數（個）7.09±2.54*3.79±1.58*4.00±2.10*2.35±1.20關節壓痛數（個）12.26±3.09*9.36±2.37*10.38±2.43*6.83±1.90 ESR（mm/h）62.24±24.86*47.50±27.32*52.15±25.75*25.70±17.39 CRP（mg/L）46.49±34.38*29.76±31.30 27.32±23.86*11.87±13.01 RF（RU/ml）481.95±879.61 229.01±370.63 470.23±639.72 309.39±349.20

3 討論

RA屬于中醫學“痹證”范疇。痹證癥狀紛繁復雜，有時其外在表現不明顯，這給我們的臨床辨證分型造成了一定的困擾。這就需要一些實驗室指標來輔助中醫辨證分型，同時也是為中醫提供一些客觀化依據，讓我們更好地選方用藥。Th17細胞是2005年由Park等[3]提出的一種新的T細胞亞群，主要分泌白介素-17而不分泌γ-干擾素，可以激活補體，活化中性粒細胞釋放炎癥性因子，介導組織的炎癥反應。TH17細胞參與了RA免疫炎癥反應、滑膜增殖、骨侵蝕多個病理環節。本研究中RA患者Th17細胞表達在（2.30±0.75）%，明顯高于健康對照組（1.16±0.16）%。調節性T細胞（Treg）是由Gershon[4]提出的一類具有免疫調節作用的細胞亞群，可以降低炎性細胞因子產生，減少抗體分泌，維持自身免疫耐受。在本研究中，RA患者外周血中Th17細胞明顯升高，Treg細胞明顯下降，并且這兩者都與疾病嚴重程度相關，而且不同證型中兩者的表達也有顯著差異性。

在本研究中我們發現，濕熱痹阻證和痰瘀痹證中DAS28評分約有80%以上，而寒濕痹阻證和肝腎虧虛證所占比例較低，而肝腎虧虛證，主要是處于中疾病活動度。ESR、CRP等實驗室炎癥指標很高，相應的兩者Th17表達也較健康對照組異常升高，而Treg細胞卻顯著性降低。兩種證型患者體內Th17/Treg嚴重失衡。相關性檢驗分析提示，證候分型與疾病活動度呈現良好相關性，而與病程不相關。說明在疾病后期，患者雖有正虛之候，但當處于疾病炎癥活躍期時，仍以濕熱和痰瘀為主要證候。在本研究中，活動期的RA一部分以濕熱為著，另一部分以痰瘀為著，同時Th17細胞也是高表達，提示我們應該以清熱解毒化痰祛瘀為主，選用金銀花、虎杖等一些清熱解毒藥物抑制炎性滲出，同時兼顧瘀阻經絡，選用赤芍、牡丹皮等一些活血化瘀藥抑制血管翳生成，從而抑制體內細胞因子的致炎作用，增強抗炎作用。此外，病程日久耗傷肝腎，機體炎癥活動下降，應以健脾補腎祛寒為主，培補正氣。

由于痹證是一種慢性進行性疾病，炎癥因子在體內反復波動，耗傷人體正氣，而病久累及肝腎，又反噬筋骨關節，形成惡性循環，故在治療過程中要辨證審因，注意疾病的客觀化指標，綜合運用辨病辨證施治。