微載體規模化培養PK-15細胞增殖豬圓環病毒2型LG株的研究

豬圓環病毒2型（Porcine drcovirus type 2，PCV2）可導致動物機體免疫系統功能嚴重受損，形成免疫抑制，增強對其它多種病原體的易感性，使豬群發生難以控制的復發性疾病和多重感染。目前該病呈全球性流行，給養豬業造成巨大經濟損失。疫苗生產時的培養方式依然延用了傳統的轉瓶培養方式，工序操作繁瑣，批間與瓶間細胞生長狀態的差異導致PCV病毒滴度的不穩定。

生物反應器微載體懸浮培養其營養物質的傳遞更加充分均勻，細胞生長及病毒增殖的培養環境相對優質、恒定，整個培養過程控制精確，易于重復，疫苗產品質量均一性高等獨特優勢，受到越來越多疫苗企業關注。本研究使用7L生物反應器進行PCV2的培養，旨在進行生物反應器微載體培養PCV工藝的摸索，為進一步使用大容積生物反應器微載體進行PCV的培養奠定基礎。

一、材料與方法

1.細胞、種毒及微載體。PK-15細胞為哈藥集團生物疫苗有限公司保存；PCV2-LG株為哈爾濱獸醫研究所豬病研究室提供；Cytodex 1微載體購自美國GE公司。

2.主要試劑及儀器。胎牛血清購自美國CLARK公司；DMEM培養基購自美國GIBCO公司；7L細胞生物反應器購自荷蘭Applicon公司；豬圓環病毒2型抗原檢測試劑盒購自哈爾濱獸醫研究所；其余試劑為分析純。

3.PK-15細胞微載體培養。將處于對數生長期的PK-15細胞用胰酶消化脫壁，加入含10%新生牛血清的MEM營養液重懸并計數。在250 ml攪拌瓶中分別加入濃度為1、3和5 g/L的微載體（按照產品說明書進行水化及滅菌處理），細胞初始接種密度為0.3×106cells/ml，每天取樣進行細胞計數，即吸取搖勻后的細胞懸液1 mL置于EP管中，1 000 r/min，離心5 min后棄上清，加入1 ml 1%結晶紫溶液并混勻，37℃孵育1 h后，用移液槍吹打使微載體上的細胞脫落并保證細胞核全部釋放，稀釋后用血球計數板計數釋放的細胞核，即為細胞密度，并繪制細胞生長曲線。

4.不同接毒時間對病毒滴度的影響。將PK-15細胞以0.3×106cells/ml的密度接種于250 ml攪拌瓶中，微載體用量為3 g/L。分別在細胞生長0 h、6 h和12 h，以MOI為0.05接種PCV病毒，接毒后48 h，用無血清的MEM培養液換液1次，繼續培養，接毒后每24 h取樣測定PCV的效價。

5.接種不同MOI病毒對病毒滴度的影響。將PK-15細胞以0.3×106cells/ml的密度接種于250 ml攪拌瓶中，微載體用量為3g/L。待細胞生長6 h后，分別以MOI為0.01、0.05和0.2接種PCV2病毒，接毒后48 h，用無血清的MEM培養液換液1次，繼續培養。接毒后每24 h取樣測定PCV的效價，確定最佳收獲病毒時間。

6.生物反應器培養接種PCV2。根據攪拌瓶中摸索的病毒增殖工藝，在7L生物反應器中驗證其工藝的可行性。微載體用量為3g/L，細胞接種密度為0.3×106cells/ml，細胞接種6 h后以MOI為0.05接種PCV2病毒，接毒后48 h，用無血清的MEM培養液換液1次，繼續培養72 h收獲病毒液。生物反應器操作參數控制為DO 50%，攪拌速度100 r/min，溫度37℃，pH值7.2。

7.IPMA法檢測PCV病毒滴度。將病毒液用無血清MEM細胞培養液做10倍系列稀釋，取10-4、10-5、10-63個稀釋度，各接種96孔細胞培養板，每個稀釋度接種6孔，每孔100μl，同時設6孔無病毒作為健康細胞對照。每孔加入100μl新消化的PK-15細胞懸液，培養液為含10%新生牛血清的MEM。培養48 h，待細胞長滿單層，用冷的甲醇固定，一抗為PCV2抗體，二抗為FITC熒光抗體，AEC底物顯色液室溫顯色，置顯微鏡下觀察染色結果。結果判定：陽性細胞孔內可觀察到陽性細胞的胞漿或胞核內有典型的紅棕色著染，而陰性對照、空白對照的細胞孔內無紅棕色著染。

二、結果

1.不同濃度微載體對PK-15細胞生長的影響。當初始細胞密度為0.3×106cells/ml，微載體用量分別為1、3和5 g/L時，PK-15細胞在微載體上生長曲線如圖1所示。微載體濃度為1 g/L時，細胞快速進入生長期，但由于接種后細胞存在聚團和游離細胞不黏附的現象，雖然單個微載體上分配的細胞個數很多，但不能提供有效的黏附生長表面，不利于細胞生長。微載體濃度為5 g/L時，PK-15細胞的延遲期延長，這是由于單個微載體上分布的細胞過少，細胞生長缺乏初始密度效應而造成生長相對緩慢，最大細胞密度也最低。所以最合適的微載體濃度為3g/L，能均勻分布細胞于每個微載體表面，促使細胞快速生長，同時也為細胞的生長預留了充裕的生長表面，最終獲得較好的培養效果。

圖1 不同濃度微載體PK-15細胞生長曲線

2.不同接毒時間對病毒滴度的影響。不同接毒時間對PCV2增殖效價的影響結果如表1所示。分別在細胞培養后0、6和12小時接種病毒，其所對應的最高病毒滴度分別為106.5、106.5和106.5。細胞接種后6 h接種PCV2為最佳接毒時間，其收獲的最大病毒滴度顯著高于其余兩組。雖然理論上細胞數越多，其所收獲的病毒也應該最多，但PPV病毒只在一定范圍內滿足此規律，說明細胞密度并不是決定病毒滴度的決定性因素，而是細胞的生長狀態。

表1 不同接毒時間對病毒滴度的影響

3.接種不同MOI病毒對病毒滴度的影響。不同感染復數對PCV2增殖效價的影響結果如表2所示。過高或過低的感染復數（0.2和0.01）均導致較低的PCV2增殖效價，說明接毒劑量直接影響病毒的增殖效率。感染復數為0.05 h可以獲得較高的PCV2增殖效價，達到106.5TCID50/ml。此外各組試驗結果均顯示，隨著培養時間增加病毒毒價逐漸升高，說明換液后72 h可以作為收獲病毒的最適時間。

表2 接種不同MOI病毒對病毒滴度的影響

4.7 L生物反應器培養接種PCV2。對7 L生物反應器培養PCV2進行病毒滴度測定，各時間病毒滴度如表3所示。與250 ml攪拌瓶病毒增殖趨勢相同，病毒滴度也是隨著時間增加逐漸升高，接毒72 h病毒滴度達最高值。

表3 7L生物反應器中PCV2病毒滴度

三、討論

在細胞微載體懸浮培養的初期，細胞與微載體的接觸及黏附是一種物理性碰撞過程，控制合適的微載體與初始細胞量的比例可以達到較好的培養效果。本研究中發現微載體濃度過小會增加傳代次數，不符合生產經濟性；微載體濃度過大時，培養過程中微載體相互聚集、碰撞，使死細胞數量增加。微載體濃度為3 g/L時可以獲得均勻的細胞分布效果，細胞黏附充分，并預留了適度的細胞生長空間，細胞增殖密度和細胞存活率均獲得最好的水平。

選擇合適的接毒時間至關重要，進行PCV2培養時，應在細胞接種或未形成單層之前接種。細胞接種后0 h以MOI為0.05接種PCV2病毒，接種病毒時間較早，嚴重影響了細胞的正常生長，病毒毒價較低；細胞接種后12 h以MOI為0.05接種PCV2病毒，細胞密度有所提高，雖然理論上細胞數越多，其所收獲的病毒也應該最多，但病毒毒價并沒有細胞接種后6 h接種PCV2高。說明細胞密度并不是決定病毒滴度的決定性因素，而是細胞的生長狀態。這主要是由于PCV2病毒在增值子代病毒時需要宿主細胞DNA復制相關的酶參與，只有細胞處于指數生長前期時其DNA復制酶的活性最局，數量最多。

本研究摸索了利用微載體規模培養PK-15細胞增殖PCV2 LG株的條件，根據試驗結果確定最佳接毒時間為細胞接種后6 h，最佳接毒劑量為MOI=0.05，在此條件下增殖病毒含量最高可達106.5，表明PCV2 LG株適應在PK-15細胞內大規模增殖，為以哺乳動物細胞為基質大規模增殖病毒及制備豬圓環病毒疫苗提供依據。

參考文獻（略）