髓源性抑制細胞在免疫性血小板減少性紫癜中的臨床意義

凌奕文 張復華 趙瑩 陳焯文

1佛山市第一人民醫院血液淋巴瘤科（廣東佛山 528000）；2佛山市南海區人民醫院血液科（廣東佛山 528200）

髓源性抑制細胞（MDSCs）是一群異質性細胞，來源于骨髓祖細胞和未成熟髓細胞，表面標志為CD33+CD11b+HLA?DR-。MDSCs可通過多種途徑發揮免疫抑制功能，包括：（1）誘導一氧化氮合酶（iNOS）活性的改變，使NO的合成和分泌受到影響，從而誘導T細胞發生凋亡；（2）干擾L?精氨酸代謝通路，MDSCs細胞內高表達精氨酸酶1（Arg?1），通過消耗大量L?精氨酸使T細胞攝取精氨酸減少，最終導致T細胞功能與增殖減弱；（3）誘導調節性T細胞（Treg）增殖，從而干擾到T細胞的活化［1-2］；（4）可釋放ROS，誘導T細胞凋亡和使T細胞受體硝基化，最終影響T細胞活化；（5）下調選擇素L（CD62L）的表達，使未活化T細胞歸巢減少，不能遷移到淋巴結中被腫瘤抗原所激活，最終影響T細胞的免疫應答。原發性免疫性血小板減少性紫癜（ITP）是一種以血小板過度破壞和/或血小板生成減少為特點的自身免疫性出血性疾病。ITP的病理生理過程至今未得到闡明，T細胞異常被認為在ITP發病機制中占重要作用，一些免疫調節細胞得到關注，如Th細胞失衡［3-4］，Treg細胞數量減少及缺陷5，細胞毒性T細胞破壞血小板［6-7］。由于ITP發病機制的復雜及難治性ITP的治療困境，臨床亟需闡明ITP發病機制及尋找ITP治療新靶點。在自身免疫性疾病動物模型中，MDSCs對頭發、胰腺起保護作用，抑制其病理損傷［8-9］；同時，MDSCs對神經系統起病理損傷作用［10］，這使得MDSCs可能成為治療自身免疫性疾病的新靶點。但是，在ITP這個自身免疫性出血性疾病中，MD?SCs起的作用未得到闡明。本文通過研究MDSCs及淋巴細胞亞群在ITP患者發病及治療過程中的動態變化，進一步探討ITP的發病機制，為ITP的診療提供理論依據。

1 資料與方法

1.1 臨床資料2016年1月至2017年8月接受治療的ITP患者55例，其中男19例，女36例，中位年齡34歲（17～55歲）；健康體檢者60例，其中男21例，女39例，中位年齡33歲（21～57歲）。所有ITP患者均符合文獻［11］中的診斷標準，排除常見導致繼發性血小板減少病因，如自身免疫性疾病、腫瘤、藥物因素等。排除標準：（1）心、肝、腎等重要器官功能異常者；（2）合并重癥感染；（3）妊娠；（4）血栓病史；（5）失訪患者。ITP初始治療給予標準劑量的糖皮質激素［潑尼松1 mg/（kg·d），或等效地塞米松、甲潑尼松］或沖擊治療（甲潑尼松0.5～1.0 g/d，3 d），根據臨床出血情況及PLT水平，決定是否給予丙種球蛋白沖擊及血小板輸注，單用糖皮質激素治療無效，則加用重組人血小板生成素、艾曲波帕、切脾或環孢素等二線治療。

1.2 研究方法55例ITP患者作為研究組，60例健康體檢者作為對照組。分別檢測對照組、研究組外周血中MDSCs水平、T細胞亞群、iNOS及ARG表達。采用流式細胞術（FACS）檢測外周血中MD?SCs、T 細胞亞群，檢測管加入：（1）CD11b?FITC、CD33?PE、HLA?DR?APC單抗各 7 μL；（2）CD8?PE、CD4?APC、CD3?PECY5；（3）CD4?FITC、CD25?PECY5。對照管加入鼠抗人IgG?FITC、IgG?PE、IgG?APC、IgG?PECY5單抗各7 μL。各管再加入120 μL全血，避光孵育20 min。（2）加入紅細胞裂解液3～4 mL，避光孵育8～10 min。（3）PBS洗滌2次（1 000 r/min，5 min），最后500 μL PBS重懸，流式細胞儀檢測。每份標本測定5 000個細胞，全部數據用流式細胞儀自帶軟件獲取和分析，測定MDSCs、CD3+CD4+T細胞、CD3+CD8+T細胞、CD4+CD25+T細胞的百分率。

ELISA法檢測iNOS、ARG表達。步驟：（1）加樣：分別設空白孔、標準孔、待測樣品孔?？瞻卓撞患尤魏我后w，余孔分別加標準品或待測樣品100 μL，注意不要有氣泡，加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻，酶標板加上蓋或覆膜，37℃反應30 min。（2）溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板3次，每次浸泡1～2 min，200 μL/每孔，甩干，最后用力在洗水紙上拍干。（3）每孔加酶結合物100 μL，空白孔不加?；靹?，37 ℃，30 min。（4）溫育后，棄去孔內液體，甩干，洗板5次，每次浸泡1 ～ 2 min，200 μL/每孔，甩干，最后用力在洗水紙上拍干。（5）依序每孔加底物溶液90 μL，37 ℃避光顯色。（30 min內，此時肉眼可見標準品的前3～4孔有明顯的梯度蘭色，后3～4孔梯度不明顯，即可終止）。（6）依序每孔加終止溶液50 μL，終止反應，此時藍色立轉黃色。終止液的加入順序應盡量與底物液的加入順序相同。為了保證實驗結果的準確性，底物反應時間到后應盡快加入終止液。（7）在加終止液后立即進行檢測，用酶標儀在450 nm波長依序測量各孔的OD值。

1.3 療效標準參照ITP國際工作組2007年制定的療效標準［12］，完全反應（CR）：治療后PLT ≥ 100×109/L且無出血；有效（R）：治療后PLT≥30×109/L且至少比基礎PLT增加2倍，且沒有出血；無效（NR）：治療后PLT＜30×109/L或者PLT增加不到基礎值的2倍或者有出血。

1.4 統計學方法結果以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗、非參數相關分析方法，應用統計軟件SPSS 15.0分析。

2 結果

2.1 MDSCs水平研究組外周血中MDSCs比例低于對照組［（1.75± 0.34）%vs.（0.78±0.45）%］，差異有統計學意義（P＜0.05）；研究組中治療達CR及R者，治療后外周血中MDSCs比例高于發病時，差異有統計學意義（P＜0.05，表1）；研究組中治療NR者，治療后外周血中MDSCs比例稍高于發病時，差異無統計學意義（P＞0.05，表1）。

表1 研究組治療前后外周血MDSCs比例Tab.2 The proportion of MDSCs in peripheral blood beforeand after treatment in the study group ± s，%

表1 研究組治療前后外周血MDSCs比例Tab.2 The proportion of MDSCs in peripheral blood beforeand after treatment in the study group ± s，%

發病時MDSCs治療后MDSCs P值CR+R 0.76±0.39 1.65±0.36 0.003 NR 0.79±0.46 0.80±0.35 0.895

2.2 淋巴細胞亞群水平研究組外周血中CD3+CD4+細胞與CD3+CD8+細胞均高于對照組，CD4+CD25+細胞則低于對照組，差異均無統計學意義（P＞0.05，表2）。研究組中治療達CR及R者，治療后外周血中CD4+CD25+細胞比例高于發病時，差異有統計學意義（P＜0.05，表3）；研究組中治療NR者，治療后外周血中CD3+CD4+細胞、CD4+CD25+細胞比例低于發病時，CD3+CD8+細胞高于發病時，差異無統計學意義（P＞0.05，表3）。

表2 對照組與研究組患者外周血淋巴細胞亞群比例Tab.2 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood in the control group and the study group ± s，%

表2 對照組與研究組患者外周血淋巴細胞亞群比例Tab.2 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood in the control group and the study group ± s，%

組別對照組研究組P值CD3+CD4+細胞36.15±7.31 38.15±7.65 0.865 CD3+CD8+細胞28.50±7.30 32.40±6.85 0.854 CD4+CD25+細胞0.86±0.44 0.35±0.64 0.08

表3 研究組治療前后淋巴細胞亞群比例Tab.3 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，%

表3 研究組治療前后淋巴細胞亞群比例Tab.3 The proportion of lymphocyte subsets in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，%

CR+R NR CD3+CD4+細胞CD3+CD8+細胞CD4+CD25+細胞發病時37.35±7.55 30.40±6.74 0.25±0.54治療后39.35±8.35 35.35±7.15 0.95±0.63 P值0.915 0.887 0.042發病時38.65±7.75 33.40±6.96 0.38±0.69治療后37.80±7.35 36.45±6.57 0.36±0.54 P值0.924 0.858 0.835

2.3 iNOS、ARG表達研究組外周血中iNOS、ARG表達水平均低于對照組，差異有統計學意義（P＜0.05，表4）；研究組中治療達CR及R者，治療后外周血中iNOS、ARG表達水平比例高于發病時，差異有統計學意義（P＜0.05，表5）；研究組中治療NR者，治療后外周血中iNOS、ARG表達水平稍高于發病時，差異無統計學意義（P＞0.05，表5）。

表4 對照組與研究組患者外周血iNOS、ARG表達水平Tab.4 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood in the control group and the study group ± s，mIU/mL

表4 對照組與研究組患者外周血iNOS、ARG表達水平Tab.4 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood in the control group and the study group ± s，mIU/mL

組別對照組研究組P值iNOS 1.02±0.13 0.54±0.33 0.023 ARG 0.86±0.15 0.32±0.19 0.034

表5 研究組治療前后外周血iNOS、ARG表達水平Tab.5 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，mIU/mL

表5 研究組治療前后外周血iNOS、ARG表達水平Tab.5 The expression of iNOS and ARG in peripheral blood before and after treatment in the study group ± s，mIU/mL

CR+R NR iNOS發病時ARG發病時0.62±0.41 0.34±0.11治療后1.53±0.31 0.95±0.23 P值0.012 0.037發病時0.43±0.53 0.30±0.10治療后0.54±0.36 0.34±0.12 P值0.828 0.894

3 討論

ITP是一種自身免疫性疾病，現認為該病的發生主要是由免疫因素介導的巨核細胞成熟障礙與細胞毒性T細胞、自身抗體介導的PLT破壞所致［13］。但確切發病機制至今未得到闡明。ITP患者療效相差甚遠，有單用糖皮質激素可治愈的，有需要使用二線免疫抑制藥物的，亦有多藥耐藥的難治性ITP。難治性ITP的治療使得患者生存質量明顯下降，甚至不亞于惡性腫瘤。因此，尋找治療ITP的新靶點，一直是臨床熱門研究。

既往，MDSCs研究主要集中在實體腫瘤領域，其促進腫瘤免疫逃逸及其可能相關機制：（1）抑制T細胞的增殖能力［14-15］。（2）分化為2型巨噬細胞發揮免疫抑制作用［16］。（3）誘導Treg細胞的產生［17］。近年來，在血液系統疾病方面研究逐漸增多。體外實驗表明，多發性骨髓瘤患者骨髓中的MDSCs可抑制T細胞活性，而正常人的MDSCs則未表現出相關免疫抑制活性［18］。GORGUN等［19］發現MDSCs對CD8+T細胞有較強的免疫抑制活性。在淋巴瘤小鼠模型中分離的MDSCs可影響CD8+T細胞增殖［20］。而在自身免疫性疾病方面，主要研究集中在動物模型上，部分研究表明MDSCs起保護性作用，部分研究表明其介導損傷作用。至于MDSCs在ITP患者發病的病理生理過程中起的什么作用，至今少有文獻闡述。

文獻報道［21］，ITP患者體內MDSCs的數量及功能均被負向調控，大劑量地塞米松可以改變ITP患者體內MDSCs的功能。本研究通過檢測ITP患者發病及治療過程中的外周血MDSCs發現，ITP患者外周血中的MDSCs較健康者明顯下降，與文獻報道一致［21］。而治療顯效（CR+R）的患者體內MD?SCs、Treg細胞明顯上升，提示MDSCs、Treg細胞可能參與改變ITP患者免疫失衡狀態。進一步研究發現，治療顯效的患者體內iNOS、ARG表達水平高于發病時，提示MDSCs可能通過誘導iNOS活性的改變和干擾L-精氨酸代謝通路來實現其改變ITP患者免疫失衡狀態。

綜上，本研究表明，ITP患者外周血中的MDSCs較健康者明顯下降。MDSCs、Treg細胞可能參與改變ITP患者免疫失衡狀態，需要進一步實驗證實。