尖銳濕疣患者人乳頭瘤病毒分型定量結(jié)果分析及臨床意義

梁嬌 溫淑娟 蔡貞

1東莞市第八人民醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣東東莞 523325）；2南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗(yàn)科（廣州 510515）

尖銳濕疣（condyloma acuminatum，CA）是由人乳頭瘤病毒（human papillomavirus，HPV）感染引起的常見性傳播疾病，好發(fā)于外生殖器和肛周等部位，患者患處可出現(xiàn)瘙癢、出血、壓痛、灼熱等癥狀，近些年來CA發(fā)病率明顯上升，并可能引起癌變，引起人們的重視［1?4］。CA 在臨床治療方法很多，以去除疣體為主，但目前沒有完全避免復(fù)發(fā)的療法，有研究提示，治療后參與皮損中仍含有HPV病毒，以及原發(fā)損害周圍亞臨床感染蔓延，是CA頻繁復(fù)發(fā)的主要原因之一［5］，因此觀察病損及周圍部位HPV感染的變化可為療效評判及隨訪提供一個(gè)客觀的指標(biāo)。目前國內(nèi)臨床上進(jìn)行HPV DNA檢測的主要方法有實(shí)時(shí)熒光聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）法、反向點(diǎn)雜交法、雜交捕獲法。其中實(shí)時(shí)熒光PCR法具有高度特異性和靈敏性，通量高，操作簡單等優(yōu)勢，對HPV分型檢測很有優(yōu)勢［6?7］。但由于取樣時(shí)很難控制樣本中采集的脫落細(xì)胞數(shù)目，陰性結(jié)果無法排除取樣原因，且由于細(xì)胞數(shù)目不能確定也無法對病毒進(jìn)行定量分析，故而上述方法大多為定性檢測，其對治療過程中療效判斷價(jià)值有限。本研究采用多重FQ?PCR法進(jìn)行HPV分型定量檢測，通過對126例CA患者HPV分型及病毒載量檢測結(jié)果進(jìn)行回顧性研究，分析了CA患者HPV不同亞型感染概況及治療中病毒載量的變化以及該檢測方法對臨床的指導(dǎo)意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料選取南方醫(yī)院2015年12月至2016年9月皮膚性病科門診尖銳濕疣患者126例，其中男68例，女58例。患者年齡1～75歲，平均30.3歲。所有患者根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)WS 235?2003確診，且經(jīng)HPV檢測為陽性，均告知相關(guān)事宜并簽署知情同意書。發(fā)病部位以陰莖冠狀溝、龜頭、包皮系帶、尿道口、陰道口、肛周多見。納入感染型別統(tǒng)計(jì)的患者均為首次就診檢查結(jié)果，同一患者治療期間復(fù)查結(jié)果未計(jì)入內(nèi)。其中21例患者治療后復(fù)查數(shù)據(jù)用于觀察療效與病毒載量的關(guān)系。

1.2 檢測方法臨床醫(yī)師以樣本刷于疑似病變部位采集樣本后置于樣本保存液中送檢。HPV檢測采用碩世生物科技有限公司人HPV核酸分型檢測試劑盒。該試劑可檢測21種HPV亞型，具體包括18種高危亞型（HPV 16，18，31，33，35，39，45，51，52，53，56，58，59，66，68，26，82，73）及3種低危亞型（HPV 6，11和81）。提取樣本DNA后，分別加入試劑反應(yīng)管。每一樣本使用1排PCR八連管，每一管檢測以FAM、HEX、ROX標(biāo)記的3個(gè)亞型。第8管為參考基因，用于監(jiān)控并排除由于儀器故障、試劑因素、操作不當(dāng)或樣本中的抑制物等因素造成的假陰性結(jié)果，并可指示樣本取樣細(xì)胞數(shù)目是否達(dá)標(biāo)及作為定量計(jì)算參考。每次實(shí)驗(yàn)加入空白及陽性對照與檢測樣本同時(shí)運(yùn)行。檢測結(jié)果根據(jù)反應(yīng)Ct值使用試劑配套分析軟件進(jìn)行病毒載量分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法數(shù)據(jù)分析采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行分析。計(jì)量資料經(jīng)對數(shù)處理后計(jì)算其均數(shù)及標(biāo)準(zhǔn)差，高、低危組病毒載量差異及感染率差異分別采用Mann?whitney和卡方檢驗(yàn)計(jì)算P值，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HPV分型定量檢測結(jié)果概況分析126個(gè)樣本中共檢出20種基因型，包括17種高危亞型（其中HPV26型未檢出）和3種低危亞型。CA感染以低危亞型為主，HPV6、HPV11、HPV81檢出率分別為49.21%、30.95%和11.9%。分析病毒載量，低危型別組的病毒載量也明顯高于高危型別組，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析顯示兩組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.07）。見表1。

表1 126例CA患者HPV亞型感染概況Tab.1 An overview of HPV subtype in 126 patients with CA

此外，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示多重感染多見，占總感染例數(shù)37.3%，其中以二重感染多見（表2）。取感染例數(shù)多于6例的HPV亞型進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)高危型HPV常見多重感染（表3），與低危組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。如以年齡段劃分，HPV感染率以21～30歲組（48.4%）以及31～40歲組（26.2%）較高。但＜20歲年齡組患者中，多重感染比率（61.5%）明顯高于其他年齡組（表4）。

表2 126例患者HPV多重感染統(tǒng)計(jì)Tab.2 HPV multiple infection in 126 patients

表3 不同型別HPV多重感染占比情況Tab.3 HPV subtype proportion in multiple infection

表4 不同年齡階段尖銳濕疣患者HPV檢出概況Tab.4 HPV detection in patients with CA at different ages

2.2HPV分型定量用于監(jiān)測CA治療療效126例患者中有21例患者接受了光動力療法（photodynamic therapy，PDT）并且在每次PDT后進(jìn)行了HPV定量檢測，有13例（62%）患者在PDT治療后，HPV病毒量明顯下降。4～9次PDT治療后，患病部位檢測不到HPV病毒，且1個(gè)月后復(fù)查病毒載量仍為0。其余患者病毒載量僅下降1～2個(gè)數(shù)量級，甚至無下降或上升。在其中隨機(jī)挑選2例觀察其具體數(shù)據(jù)，記錄檢測結(jié)果見表5、6。病例1為單一感染HPV11女性患者，使用PDT治療3次，檢測結(jié)果顯示患者病情未見好轉(zhuǎn)，甚至病毒量有上升趨勢。病例2為青年男性患者，首次檢測為HPV6感染，治療后相隔近5個(gè)月后出現(xiàn)再發(fā)，檢測為HPV52和HPV58型，說明為再次感染而非復(fù)發(fā)，治療后病毒轉(zhuǎn)陰。

表5 27歲女性患者HPV病毒載量變化Tab.5 Changes of viral load of a 27 years old female patient

表6 31歲男性患者HPV病毒載量變化Tab.6 Changes of viral load of a 31 years old male patient

3 討論

本實(shí)驗(yàn)采用多重FQ?PCR進(jìn)行HPV分型定量檢測，在126例HPV感染CA患者中，低危型感染檢出率占92.06%，以HPV6和HPV11型為主，與國內(nèi)外文獻(xiàn)一致［8?13］。低危型組HPV病毒載量高于高危型組。HPV6、HPV11和HPV81平均病毒載量分別為1.18×107和9.48×106和1.84×106；而高危型HPV病毒載量均值大多104或105，但統(tǒng)計(jì)學(xué)分析差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，可能因?yàn)椴糠中蛣e例數(shù)偏低造成了偏差。CA患者年齡跨度較大，說明感染人群廣泛，感染人群主要集中在21～40歲（74.6%），與這個(gè)年齡段處于性活躍階段，有較高的感染概率相關(guān)［14］。多重感染比率在＜20歲組明顯高于其他年齡組，且高危型HPV感染者有更高的多重感染比率（表3、4）。通常認(rèn)為一種HPV型別感染并不造成對其他型別易感性增加，故而推測這些多種HPV亞型的感染是相互獨(dú)立的，造成多重感染的原因可能是頻繁更換性伴侶或免疫系統(tǒng)受損［15］。對于這一部分患者應(yīng)積極治療并定期復(fù)查，對于控制CA及預(yù)防癌變有積極意義［16］。

通過對治療中連續(xù)檢測病例的觀察可以發(fā)現(xiàn)監(jiān)測感染型別和病毒載量的變化對CA的療效評判及觀察疾病發(fā)展有重要指導(dǎo)意義。CA治療方法以局部去除疣體為主，一般以肉眼判斷皮損是否好轉(zhuǎn)、原有疣體是否清除，或醋酸白試驗(yàn)作為療效評判標(biāo)準(zhǔn)。但可能由于存在肉眼看不見的亞臨床潛伏感染、或某些患病部位體格檢查時(shí)無法發(fā)現(xiàn)等，導(dǎo)致治療難以徹底，而肉眼無法觀察致病病毒是否被徹底清除［5］。本研究采用的方法在HPV分型檢測的同時(shí)，通過引入上皮細(xì)胞參考基因，一方面有助于排除實(shí)驗(yàn)環(huán)節(jié)或取樣造成的假陰性；另一方面可作為基準(zhǔn)計(jì)算出感染病毒的數(shù)量?即感染單位（感染單位定義為每10 000細(xì)胞的病毒感染量）。此外，出現(xiàn)多重感染時(shí)，還可計(jì)算出不同亞型占比（表6），獲得優(yōu)勢感染亞型信息。本研究通過對21例在PDT治療期間重復(fù)檢測HPV病毒量病例的觀察，發(fā)現(xiàn)同一患者不同時(shí)間點(diǎn)以及不同采集部位，檢測結(jié)果型別很恒定，病毒載量變化與臨床觀察高度相符，這一結(jié)論也與HU等［17］的報(bào)道完全一致。本文隨機(jī)選取的病例中，患者1多部位單一感染HPV11，治療期間病毒載量無顯著下降，甚至出現(xiàn)上升趨勢。患者2最初感染HPV6，經(jīng)治療病毒轉(zhuǎn)陰。2個(gè)月后再次就診，出現(xiàn)新發(fā)感染HPV52和HPV58。以上兩個(gè)病例均可以直觀地明確治療效果，判斷復(fù)發(fā)趨勢，而定性檢測無法給出這樣的臨床信息，體現(xiàn)了分型定量檢測對于臨床治療的重要指導(dǎo)意義。

綜上所述，HPV分型定量檢測對于CA的診斷和療效監(jiān)測有著明確的指導(dǎo)意義。本研究的缺陷在于納入病例較少，且臨床資料不夠全面。對于探討低危型與高危型HPV感染病毒載量的差異對CA癥狀及治療的影響，以及病毒載量與治療效果、治療療程間的關(guān)系還需要進(jìn)一步進(jìn)行追蹤與探討。