NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態性與中國朝鮮族2型糖尿病患者下肢動脈硬化的相關性

金光明 樸蓮善

延邊大學附屬醫院1醫學影像二科，2內分泌科（吉林延吉 133000）

下肢動脈硬化（lower limb arteriosclerosise，LLAS）是2型糖尿病（Type 2 diabetes mellitus，T2DM）最常見的大血管并發癥之一，據國外文獻報道［1］，T2DM患者并發LLAS發生率達22%～46%，糖尿病病程5年、5～10年和10年以上者，LLAS發病率分別是22.6%、23%和66.7%［2］。臨床上一旦出現下肢動脈缺血的癥狀如間歇性跛行、靜息痛、缺血性壞疽等，治療相當困難，尤其是動脈硬化（ar?teriosclerosise，AS）和 硬化 斑 塊（arteriosclerosise plaques，ASP）形成引起動脈狹窄、閉塞，會導致下肢的缺血、缺氧，繼而引發下肢壞疽、壞死，這是T2DM患者截肢致殘，甚至死亡的主要原因，對人類健康危害極大。因此，對LLAS進行早期診斷、早期治療尤為重要。本課題組經過多年的研究發現，NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態性與T2DM患者頸動脈硬化、糖尿病腎病及糖尿病視網膜病變這些大血管及微血管病變存在相關性，但對于其與LLAS的關聯仍有待于研究。延邊地區是我國最大的朝鮮族聚集地，而邊疆地區少數民族的健康問題一直是黨和國家關心的問題，因此在本實驗中，探討了NADPH氧化酶p22phox亞基基因多態性在中國延邊地區朝鮮族T2DM患者中的分布情況，分析該位點的基因多態性與朝鮮族T2DM患者發生的關系，旨在從基因水平上對LLAS的發病進行早期預防、早期治療，達到造福邊疆地區少數民族患者的目的。

1 對象與方法

1.1 對象選取本院住院的朝鮮族T2DM患者298例，其中男170例、女128例，平均年齡（52.56±10.49）歲。T2DM診斷依據1999年WHO診斷標準。根據彩色多普勒超聲結果共篩選出AS患者254例，其中無斑塊（ASNP）患者191例，有斑塊（ASP）患者63例。

1.2 方法

1.2.1 臨床資料采集記錄受試者年齡、性別、血壓、病程、體質指數、吸煙、飲酒與否和實驗室檢查數據，包括空腹血糖（fasting blood glucose，FBG）、甘油三酯（triglyceddes，TG）、總膽固醇（total choles?terol，TC）等。計算體質指數（BMI）=體質量（kg）/［身高（m）］2。

1.2.2 彩色多普勒超聲檢查選擇西門子公司S 2000型多功能彩色多普勒超聲診斷儀，探頭頻率為5～7.5 MHz。受檢者檢查前靜坐或平臥10 min以上，檢查前1 h禁止抽煙、飲酒等。選用動脈血管條件模板，取樣容積3～5 mm，探頭置于血管縱切面中央，聲速與血流夾角＜60°。掃查股總動脈、股淺動脈時受檢者取仰臥位，掃查腘動脈時取俯臥位，囑患者雙下肢伸直，稍分開。檢查時注意兩側對比，利用二維超聲顯示下肢動脈縱切面的圖像，將探頭輕輕沿血管走行滑行掃查，測量內-中膜厚度（intima?media thickness，IMT），以IMT ≥ 1 mm作為AS診斷標準，以IMT≥ 1.5 mm為ASP形成標準［3］。見圖1。

1.2.3 DNA提取和基因型檢測應用DNA Purifi?cation Kit提取DNA，具體材料為Promega公司提供的Wizard?Genomic。上游引物為：5′?TGCTTGTG?GGTAAACCAAGGCCGGTG?3′，下游引物為：5′?AA?CACTGAGGTAAGTGGGGGTGGCTCCTGT?3′。之后取PCR擴增產物進行酶切反應，將反應后消化片段在2.5%瓊脂糖凝膠上電泳，所得條帶經紫外燈拍照，判定結果后記錄。

圖1 AS和ASP彩色多普勒超聲對比圖Fig.1 Contrast image of AS and ASP in color Doppler ultrasonography

1.3 統計學方法應用SPSS 15.0統計軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差表示，采用χ2檢驗進行比較。等位基因和基因型頻率采用直接計數法統計，χ2檢驗評估C、T等位基因的Hardy?Weinberg平衡偏離度。Logistic回歸分析評估NADPH氧化酶p22phox亞基242位點基因突變和其他危險因素與ASP相關性。P＜0.05認為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 NADPH氧化酶p22phox亞基242位點基因型結果NADPH氧化酶p22phox亞基基因PCR擴增產物片段大小為348 bp，應用限制性內切酶RSA I酶切后，可見3種基因型，出現348 bp一條帶的為CC純合子基因型，出現348 bp、160 bp、188 bp三條帶的為雜合子CT基因型，出現160 bp、188 bp兩條帶的為TT純合子基因型。見圖2。

圖2 NADPH氧化酶p22phox亞基242位點基因型凝膠電泳圖Fig.2 NADPH oxidase subunit p22phox gene 242 genotype detected by DNA 2.5%agarose gel electrophoresis

2.2 ASNP組和ASP組基因多態性分布的比較NADPH氧化酶p22phox亞基242位點純合子CC基因頻率與雜合子CT及純合子TT基因進行比較，發現差異存在統計學意義（χ2=3.928，P＜0.05），見表1。

表1 ASNP組和ASP組NADPH氧化酶p22phox亞基242位點CC基因型和CT+TT基因型分布比較Tab.1 The frequencies of p22phox242 genotypes and alleles in ASNP group and ASP group

2.3 一般臨床資料比較ASP組SBP（mmHg）顯著高于ASNP組［（166.53 ± 15.74）vs.（154.86 ± 15.16）］mmHg（P＜ 0.05），在是否吸煙方面，ASP組吸煙人數比例明顯高于ASNP組（P＜0.05），但在DBP、年齡、性別、病程、BMI、FBG和血脂方面無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

表2 ASNP組和ASP組臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data between ASNP Group and ASP Group±s

表2 ASNP組和ASP組臨床資料比較Tab.2 Comparison of clinical data between ASNP Group and ASP Group±s

注：BMI，體質指數；SBP，收縮壓；DBP，舒張壓；FBG，空腹血糖；TC，膽固醇；TG，甘油三酯；LDL，低密度脂蛋白；Cr，肌酐；*P＜0.05

項目年齡（歲）男性［例（%）］女性［例（%）］吸煙［例（%）］飲酒［例（%）］病程（年）BMI（kg/m2）SBP（mmHg）DBP（mmHg）FBG（mmol/L）TC（mmol/L）TG（mmol/L）LDL（mmol/L）Cr（mmol/L）ASNP（n=191）52.13±10.19 101（52.8）90（47.2）63（33.0）119（62.5）15.76±2.29 24.15±5.01 154.86±15.16 97.35±10.18 10.81±1.43 4.29±1.56 1.48±0.85 2.77±0.39 57.48±38.11 ASP（n=63）54.29±10.11 34（55.4）29（44.6）50（79.4）38（60.9）15.83±2.62 24.11±4.92 166.53±15.74*99.56±10.22 11.60±1.39 4.38±1.40 1.53±0.91 2.75±0.76 55.41±40.06

2.4 ASP危險因素的Logistic回歸分析將AS患者視為一個隊列人群，以是否合并ASP為自變量，年齡、性別、病程、吸煙、飲酒、BMI、SBP、DBP、FBG、TC、TG以及是否存在C242T突變為因變量，進行logistic回歸。表3結果顯示，病程和吸煙是ASP的獨立危險因素，而C等位基因突變是ASP的風險因素，存在C突變的T2DM患者合并ASP風險增高58%。見表3。

表3 ASP危險因素的Logistic回歸分析Tab.3 Logistic regression analysis of risk Factors of ASP

3 討論

T2DM患者主要表現為糖代謝與脂代謝的雙重紊亂，其高血糖和高血脂狀態狀態會造成血管內血小板聚集，血液黏滯度增高，動脈內皮細胞發生缺血缺氧，最終導致血管屏障功能受損［4］，在彩超上主要表現為動脈IMT彌漫性增厚形成AS，嚴重者形成ASP，繼而造成管腔狹窄、甚至閉塞。

NADPH氧化酶的主要成分是細胞色素b558，它的輕鏈22 kD多肽（p22phox）被證實與酶活性密切關聯，研究發現其可以大量生成氧自由基［5］，氧自由基引起的氧化應激是血管病變發病的基礎環節［6］。NADPH氧化酶p22phox亞基242位點的基因突變導致組氨酸轉變為酪氨酸，這會產生大量血管內皮活性氧ROS［7］；ROS一方面促進動脈血管基底膜剝脫，造成動脈血管足突細胞死亡［8］，另一方面，它還可以阻止動脈血管基質降解，促進AS甚至ASP的形成，這主要是通過促使動脈血管細胞分泌血管內皮生長因子（VEGF）來完成的。NADPH氧化酶p22phox亞基242位點基因突變造成AS的另外一個原因就是降低了NADPH氧化酶的活性，導致動脈血管細胞的凋亡和NO的合成減少，引起動脈血管痙攣、血小板聚集，斑塊形成［9-10］。

種族和生活環境的差異被認為與疾病差異性密切相關，朝鮮族飲食習慣中鹽分含量高，男性喜飲酒、吸煙，這些均被認為是造成T2DM的高風險因素。其具體機制為煙草中的氧自由基等物質，會損傷患者的血管內皮，造成血管活性平衡失調，增加患者血管的僵硬度；另外，煙草中某些成分會導致患者的膽固醇代謝紊亂，引起血管壁膽固醇清除下降，膽固醇不斷堆積于動脈壁，加快動脈硬化的發展［11］，但在本文中并未得出飲酒與動脈硬化相關的結論，這可能與酒精在某些程度上具有促進循環的作用相關。另外，入選樣本數及入選人群中飲酒人數較少也可能是另一個原因。至于病程與ASP之間存在相關性則更好理解，隨著病程的延長，T2DM患者代謝紊亂日益加重，造成大血管病變是疾病發生發展的自然過程。

隨著基因研究的迅猛發展，越來越多的學者喜歡從遺傳、基因水平解釋疾病易感性的不同。在本研究結果顯示，在AS和ASP的患者中，NADPH氧化酶p22phox亞基242位點純合子CC基因頻率與雜合子CT及純合子TT基因頻率相比，差異顯著（P＜0.05），這與我們之前研究的該基因多態性與頸動脈、腎動脈、視網膜動脈及左心室肥厚相關的結果是一致的［12-13］。

通過本研究，筆者認為NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態性與中國朝鮮族T2DM患者ASP相關，患者中CC純合子基因是較高的危險因素。檢測患者基因型對于篩查高危人群，早發現、早治療具有重要意義。而CDUS以其價廉、無創、實時可重復等優點，具有廣泛的應用前景，但必須要提出的是操作者術水平是影響檢測結果的一個重要因素，因此應提高檢查者技術水平，按照標準操作流程進行檢查。

由于樣本含量較小時，實驗所得出的肯定性結論應用于臨床中，依據不夠全面，因此在接下來的研究中，將不斷增大樣本含量，繼續研究NADPH氧化酶p22phox亞基C242T基因多態性與T2DM患者糖代謝、脂質代謝等內分泌紊亂的相關性，進一步明確該基因多態性引起T2DM各種并發癥的機制。