神經調節因子1對老年C57BL/6J小鼠聽皮層的保護作用

楊振棟 張云美 于亞峰

蘇州大學附屬第一醫院耳鼻咽喉科（江蘇蘇州 215006）

衰老是人類不可避免的自然現象。隨著年齡的增長，各個器官都會經歷退變的過程。年齡相關性聽力下降又稱老年性聾，它的病因相當復雜，不僅與年齡相關，而且與遺傳、環境、社會等因素密切相關，是個多因素疾病。毛細胞的減少和螺旋神經元的退變被認為是周圍聽覺系統退變的主要因素［1］。近年來，中樞聽覺系統的退變也被認為伴隨著周圍聽覺系統退變從而參與了老年性聾的病理過程［2］，導致其噪聲環境下言語理解能力及處理能力的下降。聽皮層作為聽覺中樞的高層，隨著年齡的增長同樣也出現了退變［3］。如何延緩老年性聾一直是個難題，聽覺中樞神經元的再生還遙不可及。

神經調節因子（neuregulins，NRGs）作為信號蛋白，介導神經系統、心臟、乳腺和其他器官系統細胞和細胞之間的聯系。NRG1是其中一種，屬于表皮生長因子家族成員。有研究表明NRG1?ErbB信號通路在內耳的發育和成長過程中起著顯著的作用，NRG1能夠促進I型螺旋神經元的存活［4］。那么，NRG1對聽皮層神經元有無保護作用?本課題組選取老年C57BL/6J小鼠作為觀察對象，研究NRG1對其聽皮層是否有保護作用。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及材料取6～8周、42～44周的雄性小鼠分為兩組，每組10只，頸椎脫臼處死后，迅速取出雙側聽皮層并放置于液氮中，采用RTPCR的方法檢測了兩組聽皮層NRG1的表達情況。取30只42～44周C57BL/6J雄性小鼠，按使用藥物的不同分為NRG1組、m?NGF組和生理鹽水組，分別給予NRG1 0.1 mg/mL，鼠神經營養因子（mouse neurotrophic factor，m?NGF）9 μg/mL以及生理鹽水，每組10只，采用腹腔注射的方法連續給藥8周，注射劑量均為0.1 mL/d。動物經頸椎脫臼處死后，迅速取出聽皮層并放置于2%的戊二醛中固定，行透射電鏡觀察聽皮層神經元等超微結構。另取標本放置于4%的多聚甲醛中固定，行免疫組化觀察NRG1的表達變化。NRG1購自于美國的R&D systems。m?NGF購自于廈門北大之路生物工程有限公司。實驗動物購自于蘇州大學實驗動物中心，耳廓反射均可以引出。

1.2 方法

1.2.1 實時熒光定量RTPCR檢測RNA的提取按Trizol法（Invitrogen，美國）進行，確定RNA濃度后進行逆轉錄合成cDNA。反應體系：5×Prime?Script Buffer 4 μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1 μL、oligo（dT）1 μL、Random 6 mers 1 μL、Total RNA 13 μL，總體系20 μL。反應條件：37 ℃，1 h；85℃，5 min。將制備好的cDNA和定量梯度陽性標準模板進行PCR擴增，擴增體系如下：2×Super?Real PreMix Plus 10 μL、上游引物1 μL、下游引物1 μL、cDNA 8 μL，總體系20 μL。PCR擴增條件：首先50℃作用3 min，接著95℃作用15 min，95℃作用10 s，55 ℃作用20 s，72 ℃ 作用30 s，接著40個循環95℃變性10 s。溶解曲線：從70℃到95℃，每增加0.5℃作用5 s。各引物序列為AC?TIN：上游 5′?GTGACGTTGACATCCGTAAAGA?3′，下游 5′?GCCGGACTCATCGTACTCC?3′；NRG1：上游 5′?TTCCCATTCTGGCTTGTCTAGT?3′，下游 5′?CCAGGGTCAAGGTGGGTAG?3′。

1.2.2 透射電鏡取出的聽皮層組織塊切1 mm3的大小。在2%戊二醛4℃下固定2 h，PBS緩沖液漂洗后1%鋨酸4℃下固定2 h，PBS緩沖液漂洗。梯度乙醇逐級脫水。環氧丙烷置換。環氧樹脂618包埋液與環氧丙烷（1∶1）浸透2 h，環氧樹脂618包埋液與環氧丙烷（2∶1）過夜，純環氧樹脂618包埋液浸透37℃6 h。包埋，切片。枸椽酸鉛電子染色。透射電鏡下觀察。

1.2.3 免疫組化取出的聽皮層組織浸入4%的多聚甲醛固定液中過夜。固定好的組織行石蠟包埋并切片，切片厚度4 μm。石蠟切片常規脫蠟和水化，用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。切片在37℃下浸入1%BSA溶液（含0.3%triton?x?100）中封閉30 min。隨后入一抗：（NRG1 1∶100）。陰性對照組采用PBS緩沖液代替一抗。置4℃冰箱中過夜，隔1 d用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min后再入相關生物素化的二抗30 min（1∶200），用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min，然后浸入ABC溶液2 h，再用0.01 mmol/L PBS清洗3次，每次5 min。接著使用DAB顯色15 min后鏡下觀察中止反應，復染使用蘇木精。0.01 mmol/L PBS清洗終止反應后，用中性樹膠封片后即可于鏡下觀察。

1.3統計學方法所有數據以均數±標準差表示，使用SPSS 19.0軟件對數據采用正態分布檢驗、方差齊性檢驗，組間的均數比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD法，所有統計資料以P＜0.05來表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 實時熒光定量RTPCR結果以ACTIN的表達量作為參照標準來計算兩組聽皮層上的NRG1 mRNA的 ΔCt以及 ΔΔCt，最后通過計算公式2?ΔΔCT來分別計算各基因的相對表達水平。結果顯示NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠聽皮層上的表達（0.203 0±0.008 6）明顯少于6～8周（0.533 3±0.313 0），差異有統計學意義（P＜0.05）。

2.2 透射電鏡觀察結果生理鹽水組脫髓鞘改變明顯（圖1A）。NRG1髓鞘扭曲情況較生理鹽水組改善（圖1B）。m?NGF組髓鞘較NRG1組有輕度脫髓鞘改變（圖1C）。

2.3 免疫組化結果聽皮層上免疫反應產物陽性物質為棕黃色顆粒，其表達量使用IPP 6.0軟件所測得的平均光密度來表示（表1）。NRG1組NRG1的表達高于其他兩組（圖2A），而m?NGF組NRG1的表達（圖2B）高于生理鹽水組（圖2C）。

圖1 使用神經調節因子后42～44周小鼠聽皮層超微結構的透射電鏡觀察結果Fig.1 Ultrastructure of the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment observed by transmission electron microscopy

表1 3組NRG1在42～44周C57BL/6J小鼠聽皮層上的表達Tab.1 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice

3 討論

臨床上老年性聾分為中樞性、周圍性和混合性3種，以混合性居多，即老年性聾患者同時有外周聽力障礙及中樞聽覺處理障礙。一般來說老年性聾分為4類，即感音性、神經性、代謝性和機械性耳聾。后來又補充了中樞型老年性聾，即聽覺各級中樞呈現退行性變，這是導致老年人言語交往障礙的主要原因。這種現象又被稱作中樞聽覺功能障礙。

圖2 使用神經調節因子后42～44周小鼠聽皮層NRG1的表達變化Fig.2 Expression of NRG1 in the auditory cortices of 42～44 weeks C57BL/6J mice after treatment assessed with immunohistochemistry

NRG1主要表達在中樞的突觸區域，與突觸的傳遞密切相關［5］。廣泛的研究已經表明NRG1通過正向和負向信號通路在突觸傳遞中起了關鍵的作用［6］。NRG1的正向信號通路通過把細胞外的區域與ErbB受體結合，能夠調節突觸相關蛋白例如神經遞質和離子通道的表達［7］。NRG1負向信號通路通過細胞質區域的核易位能上調凋亡和突觸基因的表達［8］。

NRG1的中樞神經保護作用已經被國內外文獻多次報道，比如在帕金森病，NRG1能夠保護受損的多巴胺能神經元，能減少神經元的凋亡［9］。那么NRG1對老年鼠聽覺系統的神經元和突觸有無保護作用呢？有報道［10］NRG1在耳蝸和螺旋神經元上皆有顯著的表達。近來有實驗指出轉有NRG1基因的小鼠聽力較好，原因是由于NRG1使毛細胞和螺旋神經元間的突觸傳遞得到了增強［11］。

NRG1能否用于保護聽覺中樞尤其是聽皮層？筆者首先采用實時熒光定量RTPCR觀察NRG1在C57BL/6J小鼠聽皮層上的表達，結果發現隨著年齡增長有下降趨勢。這表明老年小鼠聽皮層退變影響了突觸的傳遞，進而影響了聽皮層的功能。XU等［12］報道NRG1作為神經保護因子，能夠保護小鼠小腦神經元免受氧化應激和神經炎癥，表明在與神經退行性疾病有關的神經炎癥有潛在治療應用。為了了解NRG1的保護作用，實驗中使用了兩種神經保護因子，一種是NRG1，一種是臨床上已經普遍使用的m?NGF，而生理鹽水作為對照。神經生長因子在體外實驗中被證明能夠促進小鼠耳蝸神經干細胞增殖和分化，其在治療神經元聽力損失中起到了保護作用［13］。腦源性神經營養因子在體外研究中也證明對耳蝸有保護作用［14］。m?NGF作為常見的外源性神經生長因子已被廣泛地認為能夠促進神經元存活和生長的能力。m?NGF能夠作用于螺旋神經元及外毛細胞進而保護聽力［15］。WANG等［16］研究認為m?NGF可作為DBA/2J小鼠的保護劑用于早期干預小鼠的進行性聽力損失。NRG1的結果如何呢？免疫組化提示使用NRG1和m?NGF以后老年小鼠的聽皮層神經元上的NRG1表達明顯增高，尤其是NRG1。而通過電鏡來觀察聽皮層的超微結構，結果發現生理鹽水組聽皮層脫髓鞘改變很明顯。m?NGF組脫髓鞘好轉，而NRG1組神髓鞘扭曲情況明顯好轉。這些結果表明神經營養因子特別是NRG1對于老年小鼠的聽皮層還是有一定的保護作用。

雖然NRG1對于周圍聽覺系統以及中樞聽覺系統均顯示出一定的保護作用。然而老年性聾是個多因素疾病，NRG1能否應用于臨床，療效如何都面臨著不小的挑戰。對于NRG1的具體機制還需要進一步的研究。