H19/miR?29b/LOX影響膠質瘤細胞侵襲能力的體外研究

李城 李昌熙 王大新 戴燕 金世光

江蘇省蘇北人民醫院1疼痛科，2醫學實驗研究中心（江蘇揚州 225001）

近30年來，原發性惡性腦腫瘤發生率逐年遞增，年增長率約為1.2%［1-2］。LncRNA H19基因位于人類染色體11P 15.5，全長2.3 kb。長非編碼RNA能夠與RNA結合蛋白相互結合進而參與蛋白質之間的相互作用；還能夠以“海綿”體形式吸附microRNA影響其對下游靶基因的調節作用［3-5］。本課題組通過生物信息學預測發現H19可能直接結合miR?29b，同時預測發現，賴氨酰氧化酶（lysyl oxidase，LOX）為miR?29b的潛在靶基因。通過膠質瘤細胞系中干擾和過表達H19能夠發現負調控miR?29b的表達。miR?29b能夠調控DNMT3B?MTSS1軸來抑制肝癌細胞的上皮-間質轉化（epithelial?mesenchymal transition，EMT）發生［6］。LOX通過氧化膠原和彈性蛋白的賴氨酸殘基來起始這些纖維性蛋白的共價交聯，從而穩定細胞外基質［7-8］。有研究表明LOX能夠使細胞外膠原交聯進而促進腫瘤的發展和轉移［9］。因此，本研究深入探討LncRNA H19、miR?29b、LOX信號通路調控網絡在膠質瘤侵襲轉移中的功能作用。

1 材料與方法

1.1 試劑0.25%胰蛋白酶消化液，RNA酶，10%胎牛血清H?DMEM培養液，膠質瘤細胞系U87?2M1、SW1088（實驗室保存）。

1.2 儀器qRT?PCR儀（ABI StepOne Plus），生物安全柜 1205A（FORMA），CO2培養箱（FORMA），倒置顯微鏡IX70（OLYMPUS），超純水機（Milli?Q Advan?tage A10），正置熒光顯微鏡（Zeiss Axio Scope A1）。

1.3 實驗方法

1.3.1 熒光定量PCR檢測樣本中H19、LOX表達水平收集100例（50例正常及50例膠質瘤患者）樣本，將上述臨床樣本提取RNA和蛋白，利用熒光定量PCR檢測H19、LOX表達水平。

1.3.2 Transwell法檢測干擾和過表達H19膠質瘤細胞的克隆形成能力將轉染H19過表達或敲除的U87?2M1、SW1088膠質瘤細胞胰酶消化、離心，棄上清液，重懸于無血清培養基中，再將細胞置于含有Matrigel侵襲室內，在下室中加入有血清的培養基，于培養箱中誘導培養。次日用4%低聚甲醛室溫固定30 min，結晶紫染色15 min，棄小室內液體，用棉簽輕輕擦干，并置于顯微鏡下拍照。

1.3.3 細胞劃痕實驗檢測干擾和過表達H19膠質瘤細胞的轉移能力將H19過表達或敲除的U87?2M1膠質瘤細胞接種于6孔板中，置于培養箱中培養。次日觀察細胞，待鋪滿培養板后，用200 μL槍頭垂直畫線，形成間隙。PBS重復洗3遍，再加入不含血清的培養基，放入培養箱中培養，分別于0、24 h顯微鏡下觀察并拍照。

1.3.4 利用生物信息學軟件Starbase，TargetScan預測miR?29b的靶基因通過生物信息學系統分析了潛在的RNA?RNA和RNA?蛋白相互作用網絡，其中包括miRNA和LncRNA相互作用。

1.3.5 利用熒光素酶實驗檢測H19與miR?29b之間的調控關系構建H19野生型及突變型熒光素酶報告基因載體，過表達和敲除miR?29b檢測熒光素酶表達水平。（1）將細胞裂解液充分混勻，加入細胞裂解液，冰上孵育5 min，充分裂解細胞。10 000 ～ 16 000 r/min離心1 min，取上清。（2）取20 μL細胞裂解液，加至黑色酶標板中。加入100 μL螢火蟲熒光素酶反應液，震板混勻，檢測螢火蟲熒光素酶的活力，檢測盡量在30 min內完成。

1.3.6 Trans well法檢測干擾和過表達LOX膠質瘤細胞的克隆形成能力將轉染LOX過表達或敲除的U87?2M1、SW1088膠質瘤細胞胰酶消化、離心，棄上清液，重懸于無血清培養基中，再將細胞置于含有Matrigel侵襲室內，在下室中加入有血清的培養基，于培養箱中誘導培養。次日用4%低聚甲醛室溫固定30 min，結晶紫染色15 min，棄小室內液體，用棉簽輕輕擦干，并置于顯微鏡下拍照。

1.3.7 細胞劃痕實驗檢測干擾和過表達LOX膠質瘤細胞的轉移能力將LOX過表達或敲除的U87?2M1膠質瘤細胞接種于6孔板中，置于培養箱中培養。次日觀察細胞，待鋪滿培養板后，用200 μL槍頭垂直畫線，形成間隙。PBS重復洗3遍，再加入不含血清的培養基，放入培養箱中培養，分別于0、24 h顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 統計學方法應用SPSS 12.0統計分析軟件，統計學處理采用單因素方差分析進行檢驗。P＜0.05視為差異有統計學意義。

2 結果

2.1qRT?PCR檢測長非編碼RNAH19和LOX在正常及膠質瘤100例臨床標本中進行qRT?PCR檢測，發現隨著轉移程度異常表達量越高。見圖1。

圖1 qRT?PCR檢測臨床正常及膠質瘤樣本中H19、LOX表達差異Fig.1 qRT?PCR results assessed the H19 and LOX expressions in clinical normal cells and glioma cancer cells

2.2 在膠質瘤細胞系中干擾和過表達H19能夠影響細胞的克隆形成能力在U87?2M1、SW1088膠質瘤細胞中干擾H19降低細胞的克隆能力，過表達H19增加細胞的克隆能力。見圖2。

圖2 膠質瘤細胞系U87?2M1、SW1088中干擾和過表達H19對細胞克隆形成能力的影響Fig.2 The colony formation ability was examined after intervening or over?expressing H19 in U87?2M1 and SW1088 glioma cancer cell lines

2.3 在膠質瘤細胞系中干擾和過表達H19能夠影響細胞的轉移能力在U87?2M1膠質瘤細胞中干擾H19降低細胞轉移能力，過表達H19增加細胞的轉移能力。見圖3。

圖3 膠質瘤細胞系U87?2M1中干擾和過表達H19對細胞轉移能力的影響Fig.3 The investigation of invasiveness of U87?2M1 cells afterintervening or over?expressing H19

2.4 生物信息學預測miR?29b的靶基因利用生物信息學軟件Starbase、TargetScan，發現H19能夠結合miR?29b（圖4），而且miR?29b能夠潛在靶向LOX、COL1A1、COL5A1、COL3A1、COL4A5基因。見圖5。

圖4 LncRNA?H19 靶向miR?29b預測分析Fig4 The impact of LncRNA?H19 on miR?29b expression

圖5 miR?29b靶向基因預測Fig.5 The prediction of miR?29b targeted gene sequences

2.5 在膠質瘤細胞中干擾和過表達H19能夠影響miR?29b的表達熒光素酶實驗檢測發現在膠質瘤細胞中干擾H19增加miR?29b的表達，過表達H19降低miR?29b的表達。見圖6。

圖6 過表達和干擾H19后miR?29b表達情況Fig.6 The expressions of miR?29b after overexpressing or intervening H19

2.6 在膠質瘤細胞系中干擾和過表達LOX能夠影響細胞的克隆形成能力U87?2M1、SW1088膠質瘤細胞中干擾LOX降低細胞的克隆能力，過表達LOX增加細胞的克隆能力。見圖7。

2.7 在膠質瘤細胞系中干擾和過表達LOX能夠影響細胞的轉移能力U87?2M1膠質瘤細胞中干擾H19降低細胞轉移能力，過表達H19增加細胞的轉移能力，見圖8。

3 討論

圖8 膠質瘤細胞系U87?2M1中干擾和過表達LOX，檢測細胞的轉移能力Fig.8 The impact of overexpression or knockdown of LOX on the transformative ability of U87?2M1 glioma cancer cells

圖7 膠質瘤細胞系U87?2M1、SW1088中干擾和過表達LOX，檢測細胞的克隆形成能力Fig.7 The influence of overexpression or knockdown of LOX on the colony formation of U87?2M1 and SW1088 glioma cancer cells

據文獻報道，中國腦膠質瘤年發病率為3～6人/10萬人，年死亡人數達3萬人，手術加放化療的平均生存期僅為8～11個月［10］。根據世界衛生組織的分類系統及惡性程度，腦膠質瘤可分為Ⅰ～Ⅳ4個等級。Ⅰ和Ⅱ級膠質瘤惡性程度較低，Ⅲ和Ⅳ級膠質瘤惡性程度很高，平均生存期僅1年左右，是威脅人類生命健康最嚴重的惡性腫瘤之一［11-13］。目前對于膠質瘤的治療方法包括手術治療、化學藥物治療、放射治療、生物治療等。然而，預后的改善仍然較為有限［14-15］。尋找有效的神經膠質瘤分子診斷標記和分子靶點，阻斷腫瘤細胞的惡性增殖和轉移，提升治療效率一直是迫切需要解決的臨床課題。

本研究對臨床膠質瘤標本進行檢測，發現隨著膠質瘤轉移程度異常高表達長非編碼RNA?H19、LOX。繼而，本研究發現在U87?2M1、SW1088細胞系進行干擾和過表達H19、LOX，能夠影響細胞的克隆形成及轉移能力。表明LncRNA?H19、LOX在膠質瘤發生發展中發揮重要的作用。通過生物信息學預測發現H19可能直接結合miR?29b，LOX為miR?29b的潛在靶基因。同時H19能夠負調控miR?29b的表達。本研究從臨床組織水平入手，將闡明LncRNA?H19和miR?29b在正常及膠質瘤中的表達水平及相互關系，擬構建一個LncRNA?H19、miR?29b和靶基因LOX信號通路調控網絡，擬揭示對膠質瘤轉移的作用機制，同時過表達和敲除H19的穩定膠質瘤細胞株，可用于小鼠模型治療實驗，為膠質瘤靶點治療提供依據。基于以上理論和前期實驗結果筆者提出下面幾個假設：（1）H19促進膠質瘤的發生發展和侵襲是通過結合miR?29b；（2）miR?29b靶向調節LOX基因使細胞外基質改變；（3）細胞外基質的改變介導EMT信號通路影響腦膠質瘤侵襲轉移。

為了進一步驗證該假設的正確性，在今后研究中深入探討LncRNA H19/miR?29b/LOX信號通路調控網絡在膠質瘤侵襲轉移中的功能作用，并闡明其詳細分子機制。本研究能進一步豐富長非編碼RNA的功能作用和分子機制，為膠質瘤生物治療提供新的理論依據和新的治療靶點。