G6PD缺乏女性患者行體外受精?胚胎移植結(jié)局分析

趙琴 蔡桂豐 阮永銘 曾偉榮

廣東珠海市婦幼保健院生殖中心（廣東珠海 519000）

葡萄糖?6?磷酸脫氫酶（G6PD）缺乏癥俗稱蠶豆病，是臨床常見的酶缺陷病之一［1］。其主要臨床表現(xiàn)為溶血性貧血和以未結(jié)合膽紅素升高為特點的高膽紅素血癥。成年G6PD缺乏癥患者有導(dǎo)致急性腎衰竭而影響生命安全的危險，而新生兒則以核黃疸為主要癥狀，嚴(yán)重者會造成永久性神經(jīng)系統(tǒng)損傷［2］。G6PD缺乏癥是WHO公布的須預(yù)防并控制的六種遺傳病之一，我國廣東省也將其列入出生缺陷干預(yù)病種［3］。“十三五”國家重點研發(fā)計劃重點專項提出生殖健康與出生缺陷防控，隨著接受體外受精?胚胎移植（IVF?ET）治療的不孕不育人數(shù)逐年上漲，其中G6PD缺乏的患者行IVF?ET治療有無影響、對胚胎的發(fā)育潛能是否有影響，均未見報道。本研究從妊娠結(jié)局角度探討G6PD缺乏是否與卵巢衰老具有相關(guān)性以及對胚胎發(fā)育潛能的影響，為輔助生殖提供數(shù)據(jù)參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象選擇2014年6月至2016年6月在珠海市婦幼保健院生殖中心行IVF?ET/ISCI?ET的患者。其中女方G6PD缺乏行輔助生育治療的患者共有82對，病例納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）夫婦中有女方是G6PD缺乏的；（2）月經(jīng)第3天基礎(chǔ)FSH≤12.00 U/L；（3）患者年齡＜40歲；（4）移植1～2枚胚胎。根據(jù)G6PD缺乏程度進(jìn)行分組：A組，為G6PD輕度缺乏者，42例；B組，為G6PD中度缺乏者20例；C組，為G6PD重度缺乏者20例；D組，為G6PD正常對照組，100例。患者不育原因包括輸卵管阻塞、多囊卵巢綜合征、子宮內(nèi)膜異位等。

1.2 方法G6PD的采用熒光斑點法測定，具體方法是：將血滴入濾紙片形成血斑待干燥，用打孔器在血片上（包括待篩查血片和質(zhì)控血片）打下一直徑3 mm的試驗血片于反應(yīng)試管中；加入反應(yīng)混合液100 μL，隨即置37℃孵育箱中30 min，用加樣槍取少量（約2.5 μL）浸出液印滴于濾紙上，立即用風(fēng)筒吹干；將濾紙置紫外燈下觀察熒光反應(yīng)。G6PD輕/中/重度缺乏的結(jié)果判斷：熒光強(qiáng)度（++）時，熒光斑點光亮，判斷為G6PD正常；熒光強(qiáng)度（+～-）時，為G6PD缺乏陽性，其中10 min顯色（+），熒光斑點暗弱，表示G6PD輕度缺乏，再過10 min輕微顯色。判斷為中度缺乏；一直不顯色（-），表示無熒光，判斷為G6PD重度缺陷。

輔助生殖技術(shù)：采用長效GnRH?a長方案降調(diào)節(jié)，在第14～20天同時也是月經(jīng)期的第3～5天后給予人重組卵泡刺激素予以控制性超排卵，絨毛膜促性腺激素（HCG）日檢測血清黃體生成素（LH）、孕酮（P）、雌二醇（E2）檢查垂體是否達(dá)到降調(diào)節(jié)標(biāo)準(zhǔn)：LH＜5U/L，E2＜50 pg/mL，雙側(cè)卵巢竇卵泡直徑均＜10 mm，子宮內(nèi)膜厚度＜5 mm。經(jīng)陰道B超檢查主導(dǎo)卵泡≥18 mm時，肌肉注射人絨毛膜促性腺激素10 000 IU，經(jīng)36～38 h后在超聲指導(dǎo)下取卵并將卵母細(xì)胞經(jīng)6%CO2恒溫培養(yǎng)3～6 h后行IVF或ICSI。并于受精16～20 h后觀察原核形成，48 h觀察四細(xì)胞情況，第3天觀察胚胎卵裂球數(shù)、碎片及胞漿發(fā)育并移植新鮮胚胎。取卵后第2天起患者肌注黃體酮60 mg/d，或陰道加用黃體酮支持黃體。觀察指標(biāo)：移植14 d后采集患者空腹靜脈血檢測，β?HCG＞3 U/L為妊娠，并于第28天行陰道B超檢查，以B超見妊囊為臨床妊娠。

1.3 胚胎評分取卵第3天評估胚胎，胚胎質(zhì)量的形態(tài)學(xué)參數(shù)為：卵裂球數(shù)目、大小、形狀、對稱性、胞漿形態(tài)、有無碎片等［4］，共分1～4個級別。1級：細(xì)胞大小均勻且形狀規(guī)則，透明帶完整。胞質(zhì)均勻，五顆粒現(xiàn)象，碎片0%～5%之間。2級：細(xì)胞大小略不均勻，形狀略不規(guī)則，胞質(zhì)可有顆粒現(xiàn)象，碎片6%～20%之間。3級：細(xì)胞大小不均勻，有明顯的形狀不規(guī)則，胞質(zhì)有顆粒，碎片21%～50%。4級：細(xì)胞嚴(yán)重不均勻，胞質(zhì)有嚴(yán)重顆粒，細(xì)胞碎片超過50%。按照胚胎細(xì)胞數(shù)（N）、卵裂球的均勻（1～4級）和碎片的多少（1～4級）［5］。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用SPSS 19.0軟件，計量資料采用表示并采用t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組臨床基本特征4組在年齡、不育年限、Gn天數(shù)、Gn劑量、血清基礎(chǔ)E2水平、基礎(chǔ)FSH水平、基礎(chǔ)LH水平、HCG日內(nèi)膜厚度、獲卵數(shù)之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表1。

表1 臨床基本特征比較Tab.1 Comparison of clinic feature ±s

表1 臨床基本特征比較Tab.1 Comparison of clinic feature ±s

組別A組B組C組D組周期數(shù)42 20 20 100年齡（歲）32.91±4.27 32.11±2.71 33.57±5.42 32.63±4.67不育年限（年）5.50±2.91 3.97±3.38 5.05±5.13 4.02±3.12 Gn天數(shù)（d）11.16±2.03 11.55±1.93 9.95±2.30 11.38±2.56 Gn劑量（支）36.34±14.12 35.35±12.42 29.82±15.74 35.27±11.34血清基礎(chǔ)E2（pmol/L）51.87±22.85 49.75±18.57 45.71±20.51 48.90±25.45血清基礎(chǔ)FSH（U/L）7.39±2.40 7.20±2.77 6.58±2.61 6.87±2.02血清基礎(chǔ)LH（U/L）5.11±2.25 6.05±2.74 5.28±1.81 5.07±2.01 HCG日內(nèi)膜厚度（mm）11.88±2.58 11.65±1.66 10.70±3.32 11.13±2.76獲卵數(shù)（個）8.62±4.98 9.90±4.70 8.10±6.49 9.49±5.24

2.2 4組的胚胎發(fā)育4組在受精率、卵裂率、可移植胚胎數(shù)之間兩兩比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

表2 4組的胚胎發(fā)育情況Tab.2 The situation of embryo

2.3 4組患者的臨床結(jié)局4組在種植率、臨床妊娠率之間兩兩比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 患者臨床結(jié)局的比較Tab.3 Comparison of Clinic Outcome

3 討論

G6PD缺乏癥是我國華南地區(qū)最常見的不完全顯性遺傳性溶血性疾病，是新生兒溶血及某些感染性溶血疾病的遺傳基礎(chǔ)，G6PD缺乏導(dǎo)致的新生兒黃疸可造成核黃疸死亡或智力低下［6］，G6PD缺陷癥能減少對惡性瘧疾感染的風(fēng)險［7］，G6PD與其他疾病的關(guān)聯(lián)性一直以來是研究的方向，特別是遺傳性疾病在子代傳遞中的影響明顯。如G6PD酶與地中海貧血珠蛋白的復(fù)合雜合基因突變會有不同的臨床表型［8］，這是因為在地中海貧血的患者中，不同基因突變類型患者溶血程度不同，所以其體內(nèi)新生的紅細(xì)胞比例也不一致，導(dǎo)致G6PD酶活性程度增高不同。很多研究已經(jīng)表明，帶有遺傳病基因的胚胎，其種植率明顯低于正常人群，其流產(chǎn)率也明顯高于正常人群，因此，G6PD作為一種遺傳疾病，其會不會也出現(xiàn)這種現(xiàn)象，值得繼續(xù)探索。本研究探討了G6PD缺乏的不孕不育患者行ART的妊娠結(jié)局，了解該類患者與普通患者行ART治療是否存在差異的結(jié)局，同時，不同G6PD缺乏程度，是否也存在妊娠結(jié)局的差異。

本研究結(jié)果顯示，G6PD缺乏的女性不孕患者，不管其G6PD缺乏程度如何，其受精率、卵裂率、種植率、妊娠率及流產(chǎn)率均與對照組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義，故其行輔助生殖治療前可充分知情同意告知。為什么會產(chǎn)生這種與大多遺傳病妊娠結(jié)局的差異，YANG等［9］的研究顯示，G6PD的一個主要任務(wù)就是產(chǎn)生NADPH，G6PD缺乏導(dǎo)致了NADPH生成減少，細(xì)胞容易受到氧化作用而損傷，因此，G6PD缺乏與細(xì)胞的代謝損傷有關(guān)，影響了胚胎的發(fā)育。WU等［10］的研究顯示了G6PD缺乏癥和細(xì)胞信號通路調(diào)控相關(guān)，G6PD的缺失會影響胚胎的發(fā)育。全球已報道的140多種G6PD基因突變類型大多數(shù)為單堿基置換錯義突變的氨基酸置換［11］，從而導(dǎo)致酶結(jié)構(gòu)域活性中心改變，使G6PD酶活性降低。G6PD基因定位于X染色體上，遵循X連鎖不完全顯性遺傳規(guī)律［12］：男性只有1條X染色體，可根據(jù)是否攜帶G6PD突變基因而分為正常基因型和G6PD缺陷型；女性則根據(jù)兩X染色體，是否攜帶突變基因而分為正常基因型、雜合子、突變純合子，突變純合子女性為G6PD缺陷患者；雜合子女性為突變基因攜帶者，由于存在X染色體隨機(jī)失活現(xiàn)象，G6PD缺乏與正常的紅細(xì)胞呈一定比例的嵌合狀態(tài)，不同個體嵌合比例不同而G6PD酶缺陷的程度也不同，女性雜合子約10%具有G6PD缺乏癥狀，同時約10%無G6PD缺乏癥狀，因G6PD酶活性范圍大而難以根據(jù)酶活性做出準(zhǔn)確判斷。目前常用的方法是G6PD酶活性檢測［13］，G6PD缺乏的酶活性可以表現(xiàn)正常，中度缺乏或顯著缺乏，這種基于G6PD酶活性的測定方法未對正常、中度缺乏和顯著缺乏劃分出明確的界限值。由于這種表型與基因型間的明顯不一致，使得女性雜合子個體很難有效檢出［14］，而女性雜合子有可能發(fā)展為有癥狀G6PD缺陷的可能。因此通過G6PD基因突變檢測方法檢測基因突變類型來探討與不孕不育疾病的關(guān)系（與妊娠結(jié)局的關(guān)系）仍在繼續(xù)探索之中。