蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌發(fā)酵液中根皮苷主要降解成分分析

李春陽(yáng) 曲新生 李書(shū)芳

1 試驗(yàn)?zāi)康?/h2>

根皮苷是一種存在于植物組織中的物質(zhì)，在蘋(píng)果樹(shù)組織中含量很高，被認(rèn)作是蘋(píng)果樹(shù)貯存碳水化合物的一種形式。蘋(píng)果樹(shù)腐爛病是一種蘋(píng)果樹(shù)皮干腐爛病，通常是由于感染蘋(píng)果黑腐皮殼菌所引起的，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病可以侵染蘋(píng)果樹(shù)的多個(gè)部位，嚴(yán)重影響了蘋(píng)果樹(shù)的健康，從而造成經(jīng)濟(jì)上的損失。雖然國(guó)內(nèi)外已經(jīng)有很多人研究了蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌，但還未有人準(zhǔn)確表明到底是何種物質(zhì)使得蘋(píng)果樹(shù)中根皮苷發(fā)生降解。因此，現(xiàn)以蘋(píng)果樹(shù)腐爛病的病原菌及發(fā)酵液中的多種物質(zhì)作為研究對(duì)象，對(duì)根皮苷的降解進(jìn)行試驗(yàn)研究，進(jìn)而分析出影響根皮苷降解的物質(zhì)，從而揭示出腐爛病的發(fā)病機(jī)理，為蘋(píng)果樹(shù)的種植管理提供理論依據(jù)。

2 試驗(yàn)方法

2.1 以根皮苷為碳源培養(yǎng)的病原菌發(fā)酵液及其對(duì)根皮苷的降解作用 將根皮苷作為培養(yǎng)病原菌的碳源，并保持培養(yǎng)基中的根皮苷濃度為1 g/L。在培養(yǎng)基中加入幾塊蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌菌餅，室溫培養(yǎng)，培養(yǎng)過(guò)程中保持靜置，每天定時(shí)進(jìn)行振搖。培養(yǎng)10 d左右，用布氏漏斗進(jìn)行抽濾，得到病菌菌絲，在烘箱中80 ℃烘干并稱取質(zhì)量。取另一份發(fā)酵液，用濾膜過(guò)濾，將得到的無(wú)菌發(fā)酵液稀釋10倍，檢測(cè)根皮苷含量，試驗(yàn)過(guò)程中將不接菌培養(yǎng)作為對(duì)照物[1]。

2.2 以淀粉為碳源培養(yǎng)的病原菌發(fā)酵液及其對(duì)根皮苷的降解作用 發(fā)酵液的發(fā)酵方法與根皮苷為碳源的方法一致，發(fā)酵培養(yǎng)30 d左右，用濾膜過(guò)濾，將得到的無(wú)菌發(fā)酵液稀釋至含根皮苷0．1 g/L，搖勻靜置10 d后檢測(cè)根皮苷含量，檢測(cè)過(guò)程中以0．1 g/L根皮苷溶液作為對(duì)照物。

2.3 有機(jī)酸、蛋白類物質(zhì)對(duì)根皮苷的降解作用 首先，將以離子交換樹(shù)脂進(jìn)行溶脹處理，隨后用4%鹽酸浸泡0．5 h后抽濾，用二次水洗至中性。然后，用3%氫氧化鈉溶液浸泡0．5 h，再進(jìn)行抽濾并洗至中性。將預(yù)處理好的樹(shù)脂裝柱，將無(wú)菌發(fā)酵液倒入柱子中，使有機(jī)酸交換到陰離子交換樹(shù)脂中，過(guò)完柱子后用0．15 mol/L的氨水進(jìn)行脫洗，脫洗后的溶液減壓蒸餾出去殘留氨水，用鹽酸調(diào)至pH為3．5，得到有機(jī)酸液。在有機(jī)酸液中加入硫酸銨，沉淀發(fā)酵液中的蛋白類物質(zhì)，用半透析膜進(jìn)行透析處理得到粗蛋白液，將粗蛋白液進(jìn)行冷凍干燥，得到蛋白類物質(zhì)。發(fā)酵剩余液即除去有機(jī)酸和蛋白類物質(zhì)之后的發(fā)酵液。將0．1 g/L的根皮苷水溶液作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，分別檢測(cè)含根皮苷0．1 g/L的有機(jī)酸溶液、含根皮苷0．1 g/L的發(fā)酵剩余液以及漢根皮苷0．1 g/L、蛋白類物質(zhì)1 g/L的水溶液。再分別配制含根皮苷0．1 g/L以及不同濃度蛋白類物質(zhì)的水溶液，以空白物質(zhì)作為對(duì)比參照物，測(cè)定不同濃度蛋白類物質(zhì)對(duì)根皮苷降解的影響。對(duì)于根皮苷降解時(shí)間的影響則用含根皮苷0．1 g/L、蛋白類物質(zhì)0．1 g/L的水溶液，分別在室溫下靜置降解不同時(shí)間[2]。

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌對(duì)根皮苷的降解作用 以根皮苷為碳源培養(yǎng)的腐爛病菌中，每100 mL發(fā)酵液含干質(zhì)菌絲48 mg，說(shuō)明蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌是以根皮苷作為碳源的。在病原菌發(fā)酵后，檢測(cè)到的根皮苷低于不接菌培養(yǎng)的對(duì)照物，并且病原菌對(duì)根皮苷的利用率高達(dá)90%。

3.2 蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌發(fā)酵液對(duì)根皮苷的降解作用 通過(guò)淀粉培養(yǎng)的無(wú)菌發(fā)酵液在處理根皮苷后，發(fā)酵液中幾乎不含根皮苷，說(shuō)明發(fā)酵液中含有特定物質(zhì)可以徹底降解根皮苷，而且無(wú)菌發(fā)酵液降解根皮苷的效率為99%以上。

3.3 發(fā)酵液中各其他成分對(duì)根皮苷的降解作用 之前分別提取了有機(jī)酸、蛋白類物質(zhì)及發(fā)酵剩余液，并分別進(jìn)行了根皮苷的降解試驗(yàn)，目的是為了找出發(fā)酵液中能夠降解根皮苷的物質(zhì)種類。經(jīng)過(guò)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果的分析，有機(jī)酸與發(fā)酵剩余液在試驗(yàn)后的溶液中根皮苷含量幾乎沒(méi)有變化，說(shuō)明這兩種物質(zhì)根皮苷幾乎沒(méi)有降解作用。而蛋白類物質(zhì)在試驗(yàn)后溶液中根皮苷含量明顯降低，其對(duì)根皮苷的降解率在90%，說(shuō)明發(fā)酵液中蛋白類物質(zhì)才是降解根皮苷的主要活性物質(zhì)。經(jīng)推測(cè)，這些蛋白類物質(zhì)的作用與降解細(xì)胞壁酶類相似。而且由試驗(yàn)結(jié)果可知，時(shí)間越長(zhǎng)，蛋白類物質(zhì)越多，對(duì)根皮苷的降解作用越明顯。

4 結(jié)論

該文通過(guò)試驗(yàn)證明了根皮苷被蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌作為碳源長(zhǎng)期利用的原因?yàn)椋禾O(píng)果樹(shù)腐爛病菌發(fā)酵過(guò)后生成了某種特殊物質(zhì)，從而產(chǎn)生了能夠降解根皮苷的能力。隨后又通過(guò)試驗(yàn)表明，蘋(píng)果樹(shù)腐爛病菌發(fā)酵過(guò)程中所產(chǎn)生的蛋白類物質(zhì)是降解根皮苷的主要物質(zhì)。發(fā)酵液中存在的有機(jī)酸類及發(fā)酵剩余液中其他物質(zhì)對(duì)根皮苷的降解作用非常低，幾乎不具有降解根皮苷的能力。至于蛋白類物質(zhì)中何種物質(zhì)起到主導(dǎo)作用，目前還無(wú)法確定，有待進(jìn)一步研究。

[1]2017年蘋(píng)果樹(shù)腐爛病防控技術(shù)方案[J]．山東農(nóng)藥信息，2017（5）：22．

[2]鄭慶偉．丁香酚、愈創(chuàng)木酚對(duì)蘋(píng)果樹(shù)腐爛病病原菌均有抑制效果[J]．農(nóng)藥市場(chǎng)信息，2017（20）：122-123．