體外長期培養的人神經干細胞對大鼠帕金森病模型的藥效初探

陳世明，董文心，章瑾，宣丹英，顧豐華，毛鐘鳴，陳婕美，陳嘉，劉翔，陳鵬翾，趙燁

帕金森病（Parkinson's disease，PD）是一種發生在中老年期常見的神經系統變性疾病，以中腦黑質多巴胺能（dopamine，DA）神經元變性壞死和紋狀體區多巴胺能神經元水平減少為主要病理特點[1]。目前臨床上的治療方法都只能改善癥狀，無法阻止病情的發展。因此一些細胞移植的創新療法成為近年來研究熱點[2-3]。

人神經干細胞（human neural stem cells，hNSCs）存在于神經系統中，是一類具有自我更新復制，能分化為神經元、星型膠質細胞和少突膠質細胞的多潛能干細胞[4-5]。神經干細胞通過體外擴增培養，移植到病人體內，向神經系統病變部位趨行、聚集，并存活、增殖、分化為神經元和膠質細胞，從根本上補充缺失和缺損的多巴胺能神經元，成為治療神經系統損傷和神經退行性疾病的新方法[6-7]。但由于技術原因，神經干細胞在體外培養存在易分化和易死亡的技術難題[8-9]，目前獲取途徑主要是從胚胎或流產胎兒中分離并進行有限的擴增培養，這樣的神經干細胞來源混雜，無法達到標準化，且存在著倫理問題。因而如何確保神經干細胞來源穩定、標準、用之不竭成為臨床治療帕金森病的關鍵[10-11]。本研究從流產胎兒中分離神經干細胞，在體外長期規模化培養和擴增，并探討是否能改善帕金森模型大鼠旋轉行為及其移植后腦內存活和分化情況，解決臨床上人神經干細胞治療帕金森病細胞來源困難這一關鍵問題。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 DMEM/F-12（1∶1）培養基購自美國 Hyclone 公司；重組人表皮細胞生長因子（rhEGF）、重組人堿性成纖維細胞生長因子（rhbFGF）、N2 神經細胞生長添加劑、B27、胰酶（TP-EDTA）均購自美國 Gibco 公司；6-羥基多巴胺（6-OHDA）、阿撲嗎啡購自美國 Sigma 公司；水合氯醛、抗壞血酸購自國藥集團化學試劑有限公司；胎牛血清購自浙江天杭生物科技有限公司。

1.1.2 實驗動物 健康雄性 Wistar 大鼠 120只，體重約 300 g，購自上海斯萊克實驗動物有限責任公司，許可證號：2007000535474。在二級清潔級大鼠飼養環境下飼養。

1.2 方法

1.2.1 PD 大鼠模型的建立 110 只大鼠經反復行為檢測確認其無旋轉行為。腹腔注射 12% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，將大鼠固定于三維腦立體定向儀上。手術區域皮膚消毒，皮正中切口，暴露前囟，使用微量注射器將 6-OHDA 分兩點（每點 2 μg/4 μl）注射進入腦內黑質致密體部位（參照Paxinos 和 Watson 鼠腦立體定位圖譜）。注射位點：第 1 點：前囟后 5.2 mm，旁開 2.2 mm，顱骨下 8.3 mm（黑質-致密體部）；第 2 點：前囟后5.2 mm，旁開 2.2 mm，顱骨下 7.8 mm（黑質-網狀-背內側層）。術畢，大鼠連續 5 d 肌肉注射青霉素以防感染，并單只單籠飼養至實驗結束。于術后7、15、22 及 30 d 分別腹腔注射阿撲嗎啡誘發大鼠向健側單向旋轉，并進行旋轉行為檢測。計數30 min，以旋轉圈數 ＞ 7 次/min 的大鼠作為成功模型。

1.2.2 細胞移植 根據文獻[12-13]連續培養12 個月的神經干細胞球，加 0.25% TP-EDTA 消化液消化，離心，棄上清液，加 DMEM/F-12 重懸細胞并計數；取神經分化細胞，加 0.25% TP-EDTA 消化液消化，離心，棄上清液，加 DMEM/F-12 重懸細胞計數。

將 PD 成功模型大鼠隨機分為 NSC 高劑量組（細胞濃度為 1.0 × 107/ml）、NSC 低劑量組（細胞濃度為 0.2 × 107/ml）、NSC 混合組（0.2 × 107/ml的神經干細胞 + 1.0 × 106/ml 的神經分化細胞）和生理鹽水對照組。PD 模型大鼠在移植前 1 d進行旋轉測試，并經口灌胃給予大鼠環孢菌素（10 mg/kg），連續給藥 3 d。PD 模型大鼠經腹腔注射 12% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，將大鼠固定于三維腦立體定向儀上。手術區域皮膚消毒，皮正中切口，暴露前囟，使用微量注射器將人神經干細胞分 2 點（每點 4 μl）注射進入腦內紋狀體部位。第 1 點：前囟前 1.0 mm，旁開 2.5 mm，顱骨下 4.5 mm；第 2 點：前囟前 1.0 mm，旁開2.5 mm，顱骨下 5.5 mm。術畢大鼠連續 5 d 肌肉注射青霉素以防感染。對照組大鼠采用相同于治療組的操作方法，在紋狀體相應靶點注射等劑量的生理鹽水。

1.2.3 行為學檢測 神經干細胞移植 10 d 后，對每只大鼠進行旋轉測試，計數 30 min。此后 3 個月內，第 2、4、5、6、8、9 周各計數 1 次，共計數 6 次。

1.2.4 腦組織切片染色 大鼠以 12% 水合氯醛（0.3 ml/100 g）麻醉后，頸部手術區域剃毛消毒。頸部正中切口，分離一側頸部總動脈并插管，經插管向腦部灌流 4% 多聚甲醛溶液，斷頭取腦。用4% 多聚甲醛固定 20 min，PBS 洗 3 次，每次5 min；0.3% TritonX-100 作用 20 min，PBS 洗3 次，每次 5 min；10% 羊血清封閉 50 min，吸棄多余血清，加 MAP-2 一抗，4 ℃ 濕盒孵育過夜，PBS 洗 3 次，每次 5 min；滴加二抗（熒光標記），室溫 50 ～ 60 min，PBS 洗 3 次，每次 5 min；甘油封片。倒置顯微鏡觀察實驗結果。

1.3 統計學處理

應用 Statistica 6.0 統計軟件對移植組和對照組的組內及組間旋轉行為測試結果進行分析，數據以±s表示，組內、組間均采用t檢驗，以P＜ 0.05 為具有統計學意義。

2 結果

2.1 PD 大鼠模型的建立

造模后大鼠存活率為 75.5%。1 個月后做旋轉測試，存活大鼠造模成功率為 39.8%。模型成功鼠腦組織切片證實大鼠注藥側黑質紋狀體區神經元染色明顯減少，有 PD 特征性改變（圖 1）。說明通過該方法建立的大鼠 PD 模型較穩定，可進行神經干細胞移植實驗。

圖 1 健康大鼠黑質部位（A）和模型大鼠 6-OHDA 毀損側黑質部神經（B）Figure 1 Substantia nigra neurons of healthy rat (A) and substantia nigra neurons was damaged by 6-OHDA (B)

圖 2 PD 模型大鼠旋轉行為的改變情況Figure 2 Changes of rotational behavior-induced by apomorphine in PD model rats in four groups

圖 3 模型大鼠干細胞紋狀體移植側神經元（A：× 40；B：× 100；C：× 200）Figure 3 Substantia nigra neurons after the cell transplantation (A: × 40；B: × 100；C: × 200)

2.2 神經干細胞移植

神經干細胞移植 3 個月內，各組僅出現 1 只大鼠在不同時間點死亡，存活率為82.2%。說明神經干細胞移植方法成熟，動物存活率高。

2.3 PD 模型大鼠行為學的改變

神經干細胞移植 10 d 后，每周做旋轉測試，其中 42.9% 的 PD 模型大鼠在移植 10 d 后均出現了行為學的改善。在隨后的 3 個月內，其余大鼠旋轉次數也明顯減少，且有進一步改善的趨勢。而生理鹽水對照組，大鼠旋轉次數沒有明顯變化。NSC 高劑量組移植 8 周后與移植前比較有顯著性差異（P＜ 0.05）；其余各組移植前后比較均無顯著差異（P＞ 0.05）。組間比較，PD 模型大鼠移植前相互比較無顯著性差異（P＞ 0.05）；NSC 混合組移植后 5、6、8、9 周與對照組比較有顯著性差異。（P＜ 0.05）；NSC 低劑量組移植后 6、8 周與對照組比較有顯著性差異（P＜ 0.05）；NSC 高劑量組移植后 6、8 周與對照組比較有顯著性差異（P＜0.05），詳見圖 2。

2.4 大鼠腦組織 MAP-2 抗體標記神經元切片結果

腦內定點移植 hNSCs 的 PD 大鼠模型，在紋狀體移植側可見一明顯針道，針道兩側明顯可見MAP-2 抗體標記的神經元，即移植存活的干細胞，（圖 3），說明植入大鼠紋狀體的 hNSCs 存活，且能分化為神經元。

3 討論

干細胞是一類具有自我復制能力和多向分化潛能的細胞，是人體的種子細胞，被醫學界稱為“萬用細胞”。以干細胞治療為核心的再生醫學，在神經、血液、心血管、生殖等系統和肝、腎、胰等器官的重大疾病治療方面發揮作用，其中神經干細胞對神經系統的損傷修復和神經退行性疾病治療方面展現出驚人的潛力[14]。與誘導性多能干細胞及間充質干細胞移植相比，人神經干細胞解決了潛在的致癌性、組織相容性和表觀遺傳性變異等問題[15-16]，但神經干細胞自身存在來源困難和數量有限的難題，因此臨床治療工作還是難以開展。本研究從流產胎兒中分離出神經干細胞，在體外連續擴增培養長達 12 個月，遺傳性穩定[12]，可為神經干細胞移植提供可靠、用之不竭的細胞來源。體外培養 12 個月的神經干細胞球分化后，可見典型的神經元形態及新型膠質細胞形態，可判斷此類細胞仍具有良好的增殖和分化能力。

帕金森病（PD）是一種起病隱匿的中樞神經系統變性疾病，主要特點為中腦黑質多巴胺能神經元的變性死亡，導致紋狀體內乃至黑質的多巴胺能神經末梢減少，從而引起震顫、肌肉僵直、運動遲緩等一系列綜合癥狀[17]。但是動物不會自然發生該病，因此，研究中需要建立大鼠 PD 模型。PD 大鼠模型的制備是采用顱內定位注射 6-OHDA，減少黑質 DA 神經元的數量，模擬人 PD 病理、行為學的改變，判定 PD 大鼠模型的成功[18-19]。本研究成功建立了大鼠 PD 模型，然后將長期連續培養的hNSCs 采用立體定向技術注射進入腦內紋狀體部位，連續 3 個月觀察移植后 PD 模型大鼠的旋轉行為，證實了神經分化細胞聯合神經干細胞移植更有利于 PD 的治療。這與神經分化細胞能夠分泌神經營養因子（BDNF），促進神經干細胞的存活和分化有關[20-21]。結果表明，hNSCs 能持續數月在大鼠腦內發揮作用，降低 PD 模型大鼠的旋轉次數，達到改善 PD 癥狀的目的。而在用神經干細胞治療PD 模型大鼠的實驗中，治療效果與移植細胞的種類和數量密切相關。

本研究用于移植的 hNSCs，在體外未經任何特殊處理，但通過 MAP-2 抗體對神經元進行標記，在紋狀體移植側發現了神經元，即移植存活的hNSCs，可推測腦內含有誘導神經干細胞分化成DA 神經元的機制。實驗中被移植的大鼠沒有出現明顯的排斥反應，也無炎癥反應，說明 hNSCs 免疫排斥反應小，適合長期在受體中存活，能起到細胞替代作用，此外，移植后該細胞還可以分化成 DA神經元，在 PD 診療方面具有很大的應用價值。

然而，本次研究僅僅在移植部位發現了存活和分化的 hNSCs，未觀察到移植 hNSCs 向周圍腦組織的遷移現象。在接下來的研究中，應對未遷移的原因及移植后多巴胺能神經元的存活時間做進一步的探討，挑選出 hNSCs 移植的最佳部位、最佳時間和生存環境，為臨床治療帕金森病提供更有力的依據。