人類BRAF 基因突變檢測試劑盒性能評(píng)價(jià)

游延軍，胡澤斌，蒲小聰，楊達(dá)梅，龍騰鑲，高飛

作者單位：611731 成都，四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測院（游延軍、蒲小聰）；611731 成都，邁克股份有限公司（楊達(dá)梅、龍騰鑲）；100050 北京，中國食品藥品檢定研究院體外診斷試劑所非傳染病診斷試劑室（胡澤斌、高飛）

BRAF 基因位于 7q34，長約 190 kb，編碼絲/蘇氨酸特異性激酶。該激酶是 RAS/RAF/MEK/ERK/MAPK 信號(hào)通路最為關(guān)鍵的激活因子，參與調(diào)控細(xì)胞的生長、分化、增殖及凋亡等[1]。BRAF 基因主要有兩種突變類型：11% 的突變發(fā)生在編碼甘氨酸環(huán)的 11 號(hào)外顯子上，如 G463、G465、G468 等點(diǎn)突變；89% 的突變發(fā)生在編碼激活區(qū)的15 號(hào)外顯子上，其中 80% ～ 90% 的突變位于第 1799號(hào)堿基上，T 突變?yōu)?A（T1799A），導(dǎo)致其編碼的纈氨酸被谷氨酸取代（V600E）[2]。在多種人類惡性腫瘤中，如惡性黑色素瘤[3]、結(jié)直腸癌[4]、非小細(xì)胞肺癌[5]、甲狀腺癌[6]等均存在不同比例的 BRAF 突變。研究表明，BRAF 基因發(fā)生V600E 突變時(shí)，病患無法從抗 EGFR 的相關(guān)靶向藥物的治療中獲益，而且還可導(dǎo)致部分 KRAS 基因野生型患者對(duì)EGFR 靶向藥物治療不敏感[7]。在腫瘤個(gè)性化治療高速發(fā)展的現(xiàn)在，檢測 BRAF 基因 V600E 的突變狀態(tài)，能夠?yàn)榕R床醫(yī)生對(duì)腫瘤患者制定個(gè)性化治療方案提供很好的依據(jù)，提高患者的生存率，減少盲目用藥，減少病患家庭的經(jīng)濟(jì)壓力。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣本 本研究的樣本是采用石蠟包埋組織提取的核酸樣本經(jīng)標(biāo)化制備的企業(yè)參考品，保存條件為 –10 ～ –30 ℃。

1.1.2 儀器和試劑 評(píng)價(jià)試劑為 A 公司的人類 BRAF基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法），擴(kuò)增分析儀器采用美國 ABI 公司的 7500 熒光定量 PCR 儀；對(duì)比試劑為經(jīng)過國家食品藥品監(jiān)督管理部門審批的已上市的 B 公司的人類 BRAF 基因 V600E 突變檢測試劑盒（熒光 PCR法）。

1.2 方法

1.2.1 準(zhǔn)確性 檢測人類 BRAF 基因突變經(jīng)標(biāo)化的陽性企業(yè)參考品 P1 ～ P3，檢測結(jié)果應(yīng)為突變陽性。

1.2.2 特異性 檢測人類 BRAF 基因突變經(jīng)標(biāo)化的陰性企業(yè)參考品（野生型人類基因組）N1 ～ N4，檢測結(jié)果應(yīng)為野生型；檢測試劑盒檢測范圍外的人類 BRAF 基因突變經(jīng)標(biāo)化的企業(yè)參考品 N5 ～ N9，檢測結(jié)果應(yīng)為未檢出突變；檢測非人類基因組樣本 N10，檢測結(jié)果應(yīng)為未檢出突變。

1.2.3 最低檢測限 10 ng 野生型人類基因組背景下，對(duì)突變比例為 1.0% 的 BRAF 基因 V600E 突變參考品 L1進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果應(yīng)為突變陽性。

1.2.4 重復(fù)性 陰性參考品（野生型）R1，檢測結(jié)果應(yīng)均為野生型；陽性參考品 R2 ～ R3，檢測應(yīng)為突變陽性且 Ct值批內(nèi)變異系數(shù)（CV%）應(yīng)不大于 5.0%。

1.2.5 抗干擾能力 將弱陽性企業(yè)參考品 L1（10 ng 野生型人類基因組背景下，突變比率低至 1%），平均分成 3 組，向樣本中分別加入等體積不同濃度的蛋白酶 K、甲醛和乙醇，同時(shí)采用純化水加入樣本作為對(duì)照，判斷是否存在干擾，Ct 均值差異 ≤ 1.0 為無干擾，Ct 均值差異 ＞ 1.0 為有干擾。

1.2.6 臨床比對(duì) 分別用 A 公司人類 BRAF 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR法）和 B 公司比對(duì)試劑盒檢測相同的臨床樣本 156 例，進(jìn)行兩個(gè)試劑盒的一致性評(píng)價(jià)。

2 結(jié)果

2.1 準(zhǔn)確性

陽性企業(yè)參考品 P1、P2、P3，每個(gè)參考品重復(fù)一次，檢測結(jié)果見表 1，根據(jù)判定規(guī)則（下同）：ΔCt = Ct體系II–Ct體系I，若 ΔCt ≤ 9，表明樣本為 BRAF 基因 V600E 突變陽性；若 ΔCt ＞ 9，表明樣本為 BRAF 基因 V600E 突變陰性。檢測結(jié)果均為突變陽性。

表 1 陽性企業(yè)參考品檢測結(jié)果

2.2 特異性

陰性企業(yè)參考品（N1 ～ N10），每個(gè)參考品重復(fù) 1 次，檢測結(jié)果見表 2，檢測結(jié)果均為野生型或未檢出突變。

2.3 最低檢測限

10 ng 野生型人類基因組背景下，對(duì)突變比例為 1.0%的 BRAF 基因 V600E 突變參考品（L1）進(jìn)行檢測，重復(fù)3 次，檢測結(jié)果見表 3，檢測結(jié)果均為突變陽性。

表 2 陰性企業(yè)參考品檢測結(jié)果

表 3 最低檢測限企業(yè)參考品檢測結(jié)果

2.4 重復(fù)性

2.4.1 重復(fù)性企業(yè)參考品 R1 連續(xù)檢測重復(fù) 10 次，檢測結(jié)果如表 4，檢測結(jié)果均為野生型。

表 4 重復(fù)性企業(yè)參考品 R1

表 5 重復(fù)性企業(yè)參考品 R2

表 6 重復(fù)性企業(yè)參考品 R3

2.4.2 重復(fù)性企業(yè)參考品 R2 連續(xù)檢測重復(fù) 10 次，檢測結(jié)果見表 5，檢測結(jié)果為突變陽性且對(duì)應(yīng)體系 Ct 值批內(nèi)變異系數(shù)（CV%）分別為 0.27%、0.68%；重復(fù)性企業(yè)參考品 R3，連續(xù)檢測重復(fù) 10 次，檢測結(jié)果見表 6，檢測結(jié)果為突變陽性且對(duì)應(yīng)體系 Ct 值批內(nèi)變異系數(shù)（CV%）分別為 0.19%、0.65%。

2.5 抗干擾能力

2.5.1 蛋白酶 K 的殘留含量對(duì)試劑擴(kuò)增的影響 在擴(kuò)增樣本中加入等體積的不同濃度的蛋白酶 K，使反應(yīng)體系中終濃度為 0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%，檢測結(jié)果如表 7，終濃度高于 0.0075% 蛋白酶 K 殘留會(huì)影響試劑擴(kuò)增。

2.5.2 甲醛的殘留含量對(duì)試劑擴(kuò)增的影響 在擴(kuò)增樣本中加入等體積的不同濃度的甲醛，使反應(yīng)體系中終濃度為0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%，檢測結(jié)果如表 8，終濃度高于 0.075% 的甲醛殘留會(huì)影響試劑擴(kuò)增。

表 7 蛋白酶 K 的殘留量對(duì)擴(kuò)增的影響

表 8 甲醛的殘留量對(duì)擴(kuò)增的影響

2.5.3 乙醇的殘留含量對(duì)試劑擴(kuò)增的影響 在擴(kuò)增樣本中加入等體積的不同濃度的乙醇，使反應(yīng)體系中終濃度為0%、0.0075%、0.075%、0.75%、7.5%，檢測結(jié)果如表 9，終濃度高于 0.75% 的乙醇?xì)埩魰?huì)影響試劑擴(kuò)增。

表 9 乙醇的殘留量對(duì)擴(kuò)增的影響

2.6 臨床比對(duì)

使用 156 例臨床石蠟包埋組織樣本比較 A 公司人類BRAF 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）和比對(duì)試劑盒進(jìn)行符合性分析，計(jì)算陽性符合率、陰性符合率、總符合率及 Kappa 系數(shù)，檢測結(jié)果如表 10。

表 10 同類產(chǎn)品比較結(jié)果

對(duì)兩種方法的檢測結(jié)果進(jìn)行符合性分析，陽性符合率為100.00%，陰性符合率為 99.15%，總符合率為 99.37%，Kappa 系數(shù)為 0.98。表明兩種方法具有高度一致性。

3 討論

本產(chǎn)品以實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 技術(shù)和引物特異性 PCR（ARMS）技術(shù)為平臺(tái)，特異性檢測 DNA 樣本中的 BRAF基因 V600E 突變。其中，試劑 1 中的特異性引物能夠在Taq 酶作用下靶向擴(kuò)增 BRAF 基因野生型和突變型模板；試劑 2 中的特異性引物在 Taq 酶作用下只擴(kuò)增突變型模板。通過兩者 Ct 差值實(shí)現(xiàn) BRAF 基因 V600E 突變的定性檢測。

ARMS-PCR 是目前實(shí)驗(yàn)室常用的基因突變檢測方法，主要優(yōu)點(diǎn)為檢測靈敏度高，可檢測腫瘤細(xì)胞中突變比例為1% 甚至更低的突變基因[8]。

通過對(duì) A 公司人類 BRAF 基因突變檢測試劑盒（熒光 PCR 法）的性能進(jìn)行評(píng)價(jià)可知，該產(chǎn)品具有重復(fù)性好，靈敏度高和特異性強(qiáng)等特點(diǎn)，滿足行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)和市場需求。