小檗堿對腸道菌的抑制作用

林媛，張紅娟，韓燕星，蔣建東

小檗堿（berberine，C20H19NO5，Mw 336.37）是一種具有廣泛藥理作用的異喹啉類生物堿，在體內可以發揮降糖、降脂、抗氧化、抗感染等多種功能[1-2]。其中，小檗堿對腸道細菌感染的治療作用是最早被人們認識并運用到臨床當中的[3]。而小檗堿治療腸道細菌感染的基礎是其容易集留在腸道中，并且有利于改善腸道菌的菌群失衡[4]。

腸道菌群是一個復雜的由多種細菌共同組成的菌群系統，參與機體的多種生理過程。早期研究中，腸道菌群更多的被認為是和消化、營養吸收密切相關。隨著研究的深入，人們逐漸發現腸道菌群還和人體的健康密切相關，比如能通過自身屏障影響機體免疫，菌群失調與糖尿病、心血管疾病、肥胖等代謝性疾病有重要關系等[5-6]。腸道菌群更像是一個隱形的“器官”，影響著人類的健康。腸道菌群種類繁多，包括腸桿菌、腸球菌、雙歧桿菌、乳酸桿菌、擬桿菌、芽孢桿菌等。在這些腸道菌中，大部分都屬于專性厭氧菌，也是共生菌。還有少數一些細菌屬于致病菌，比如導致腹瀉的痢疾志賀菌、弗氏志賀菌，引起食物中毒的沙門菌等[7]。

本文通過測定小檗堿對多種腸道微生物的體外抑制作用，以及小檗堿對代表性腸道菌群生長曲線的影響，為小檗堿與腸道菌的相互作用研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 鹽酸小檗堿購于中國藥品生物制品檢定研究院；左氧氟沙星（Levo）購于美國Sigma 公司；LB、NB、MRS、TSA、RCM 微生物培養基均購于美國 BD 公司。

1.1.2 菌株 沙門菌、弗氏志賀菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、糞腸球菌、屎腸球菌、長雙歧桿菌、短雙歧桿菌、干酪乳桿菌、嗜酸乳酸桿菌、產氣莢膜梭菌、艱難梭菌、丁酸梭菌均購買于美國標準生物品收藏中心（ATCC）；痢疾志賀菌、致病性大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、產氣腸桿菌、阿氏腸桿菌、陰溝腸桿菌、阪崎腸桿菌、單增李斯特菌購買于中國工業微生物菌種保藏管理中心（CICC）。

1.1.3 儀器 Orion Model 828 型電子 pH 計為德國 Sartorius 公司產品；MCV-B161Sb 超凈工作臺為日本 Sanyo 公司產品；NBS Innova 4 落地式變溫搖床購于德國 Eppendorf 公司；Spectrostar 分光光度計為德國 BMG Labtech 公司產品；AW 200SG 型厭氧培養箱購于英國 Electrotek 公司。

1.2 方法

1.2.1 菌種活化 取冷凍干燥的待測菌株，在超凈工作臺中接入無菌的相應液體培養基中，置于37 ℃ 搖床 180 r/min 過夜培養（需氧細菌在普通變溫搖床中培養，厭氧細菌在厭氧箱搖床中培養）。

1.2.2 藥物溶液配置 將鹽酸小檗堿用 DMSO溶解，在超凈工作臺中以 0.22 μm 微孔濾膜濾過，配置成 5 mg/ml 的藥物儲存液。之后再用相應的培養基倍比稀釋成 2.048、1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016 mg/ml 藥物使用液。左氧氟沙星也以相同的方法配置成 0.032、0.016、0.008、0.004、0.002、0.001 mg/ml 藥物使用液。同時設立不加小檗堿的相同濃度的 DMSO 溶液（也以相應的培養基稀釋）作為空白對照。

1.2.3 小檗堿對不同腸道菌群最小抑菌濃度（MIC）的測定 使用試管倍比稀釋法進行測定。取無菌試管 9 支，每支加入 1 ml 待測細菌培養液（106CFU/ml），第 1 支至第 8 支分別加入倍比稀釋的鹽酸小檗堿使用液 1 ml，至終濃度分別為1.024、0.512、0.256、0.128、0.064、0.032、0.016、0.008 mg/ml，第 9 支加入不加藥的培養基作為空白對照。左氧氟沙星也以同樣的方法稀釋至藥物終濃度為 0.016、0.008、0.004、0.002、0.001、0.0005 mg/ml。將各個試管分別置于 37 ℃ 搖床中振蕩過夜培養。12 h 后觀察細菌生長情況。與空白對照相比，液體清澈為有抑菌活性，混濁為有細菌生長。無細菌生長的最小藥物濃度即為 MIC 值。

1.2.4 小檗堿對細菌生長曲線的影響 選取有代表意義的 4 株菌株：金黃色葡萄球菌ATCC25923、痢疾志賀菌 CICC10983、弗氏志賀菌ATCC12022、沙門菌 ATCC13076。將待測菌培養至對數生長期，用相應培養基稀釋至 106CFU/ml。以鹽酸小檗堿 1/8、1/4、1/2 倍 MIC 作為加藥濃度，同時設立不加藥的空白對照。放入 37 ℃ 搖床中振蕩培養，在 0 ～ 12 h 每隔 1 小時取樣 0.5 ml。用分光光度計測量OD600值。以培養時間為橫坐標，OD600值為縱坐標，繪制不同加藥濃度下細菌的生長曲線。

2 結果

2.1 小檗堿對不同腸道菌的體外抑制作用

小檗堿對 24 株腸道菌包括需氧菌、厭氧菌，均表現出不同程度的抑制作用，尤其是對能夠引起腸道感染的痢疾志賀菌、弗氏志賀菌抑制作用較強（64 μg/ml），而對腸道正常菌群普通大腸桿菌、糞腸球菌、屎腸球菌抑制作用較弱（＞ 1024 μg/ml）（表 1）。

表 1 小檗堿對不同腸道菌群的抑制作用Table 1 The inhibitory effects of berberine to intestinal bacteria

圖 1 小檗堿對腸道菌生長曲線的影響（A：金黃色葡萄球菌；B：弗氏志賀菌；C：痢疾志賀菌；D：沙門菌）Figure 1 The effect of berberine on growth curve of intestinal bacteria (A: Staphylococcus aureus; B: Shigella flexneri; C: Shigella dysenteriae; D: Salmonella)

2.2 小檗堿對腸道菌生長曲線的影響

選取具有代表意義的腸道菌金黃色葡萄球菌、痢疾志賀菌、弗氏志賀菌、沙門菌為待測菌，繪制不同濃度下細菌的生長曲線。由圖 1 可見，無論小檗堿濃度高低，所有加小檗堿的腸道菌生長曲線在對數生長期和穩定期都位于對照組之下，表明小檗堿對對數生長期和穩定期的 4 種腸道菌均產生了明顯的抑制作用，并且隨著小檗堿濃度的增高，其抑制作用也增強。由于高濃度小檗堿溶解性不好，影響了分光光度計對OD600的檢測，所以我們只測定了低于 MIC 的小檗堿濃度對腸道菌生長的影響。在引起腸道細菌感染的痢疾志賀菌、弗氏志賀菌、沙門菌中，可以看到痢疾志賀菌生長最快，弗氏志賀菌、沙門菌生長相似且較為緩慢。加藥后，小檗堿對痢疾志賀菌的抑制也較為平緩，對弗氏志賀菌、沙門菌的抑制在對數生長期較大。小檗堿對痢疾志賀菌僅延長遲緩期，幾乎不影響其倍增時間；但是對沙門菌和弗氏志賀菌則不同，小檗堿明顯增加了沙門菌和弗氏志賀菌的倍增時間。

3 討論

本文選取 24 株常見的腸道細菌，通過在體外測定鹽酸小檗堿的抑菌活性，可以看出小檗堿的抗菌活性并不強，其 MIC 大部分在 64 μg/ml 以上，遠遠低于陽性對照藥左氧氟沙星。而臨床將小檗堿用于治療胃腸道感染卻有顯著的治療效果。我國將小檗堿用于臨床治療胃腸道感染的最早報道見于1957 年[8]，近幾十年來，廣大醫生和人民群眾都已經將小檗堿作為非處方藥用于各種腹瀉的治療。大量研究結果表明，小檗堿治療胃腸道感染的機制，除了對致病腸道菌有一定的抑制作用之外，還在于小檗堿能夠改善腸道菌群的平衡、對胃腸道黏膜功能有保護作用[9]。通過本研究的測定也可以看出，小檗堿對腸道菌群中的有害菌（痢疾志賀菌、弗氏志賀菌、沙門菌等）的抑制作用較強。也有報道指出，小檗堿還能夠增加有益的腸道菌，如能夠增加具有短鏈脂肪酸（SCFA）產生功能的Blautia和allobaculum等菌屬，而 SCFA 能夠調節腸道 pH值、抗炎、調節人體代謝與免疫[4]。

MIC 值是一個常用的反映藥物對細菌抑制作用的數值[10]，但不能反映藥物對細菌整個生長周期的影響。本文通過繪制小檗堿對 4 種代表性腸道菌作用的生長曲線，動態地反映了小檗堿作用 0 ～12 h 范圍內對 4 種腸道菌的影響。實驗結果中，我們可以看到，小檗堿對痢疾志賀菌僅延長遲緩期，幾乎不影響其倍增時間；但是對沙門菌和弗氏志賀菌則不同，小檗堿明顯增加了兩者的倍增時間。推測其原因，有可能是小檗堿通過對痢疾志賀菌某些基因的調控導致其在遲緩期的代謝受到抑制。而對于沙門菌和弗氏志賀菌，小檗堿可能主要影響其分裂期的相關基因表達或者酶的活性。具體作用機制，需要通過實驗進一步深入驗證。本研究為今后探討小檗堿抑制腸道菌生長的規律以及小檗堿與腸道菌相互作用提供一定參考。