兩種新型功能化自組裝多肽水凝膠的制備和體外研究

魯長風，楊淑慧，王沖，楊軒，陳鵬，黃紹代，王玉，汪愛媛，林秋霞，許文靜，盧世璧，彭江

自組裝多肽（SAP）納米纖維水凝膠近年來在組織工程和再生醫學領域被廣泛關注，并應用到腦、外周神經、心臟和骨的修復中[1]。分子的自組裝是分子自發從無序變為有序的過程，依靠分子之間的電荷、氫鍵、離子鍵等非共價鍵作用力實現。RADA16-I[Ac(RADA)4CONH2]是一種合成的能自發組裝的離子互補型短肽，由帶正電精氨酸（R）、疏水丙氨酸（A）和帶負電的天冬氨酸（D）交替周期性重復合成的，通過電荷的相互作用形成三維水凝膠，其含水量可達到 99% 以上[2]。RADA16-I水凝膠具有以下優點：成型方便；體內低細胞毒性、高生物相容性；纖維直徑 7 ～ 10 nm，空隙直徑 50 ～ 200 nm，類似天然細胞外基質，為細胞生長提供三維納米結構環境；黏彈性好，與腦、脊髓和神經模量相接近[3-4]。研究表明，由 RADA16-I 制備的三維納米纖維網絡能夠促進軸突生長和運動突觸的形成，對于腦修復、軸突再生以及周圍神經損傷后的功能恢復具有積極作用[5]。RADA16-I 可以通過固相合成法進一步用各種有生物活性的功能片段加以修飾，將 RADA16-I 作為小分子或蛋白質的載體，實現可控的分子釋放。由于 RADA16-I溶液酸性很強，成膠之前 pH 為 3 ～ 4，直接接觸可能會導致細胞毒性和炎癥反應，因此植入體內之前需要將 pH 調到中性[6]。另外，RADA16-I 水凝膠中缺乏細胞外基質中的各種生長因子和活性蛋白，生物活性有限，對其進行改性，即接枝功能化片段合成功能化自組裝多肽（fSAP），可以改善其強酸性的缺點，并且經過活性片段修飾的多肽分子自組裝后，活性片段可以暴露在水凝膠的表面，賦予多肽材料一定的生物學活性，從而提高自組裝多肽水凝膠的作用[7-8]。研究較多的活性片段包括層黏連蛋白來源的 IKVAV，腦源性神經營養因子（BDNF）來源的 RGI，血管內皮生長因子（VEGF）來源的 KLT，以及 BMHP1、BMHP2 等。

將功能化多肽分子 K LT 與同濃度的RADA16-I 水溶液等體積混合制備功能化自組裝多肽水凝膠，在水凝膠上進行內皮細胞和平滑肌細胞的二維和三維培養，結果表明 KLT 多肽片段有利于內皮細胞和平滑肌細胞的生長、增殖和遷移，具有促血管生成的潛能[9]。將有生物活性的短肽片段 IKVAV（Ile-Lys-Val-Ala-Val）序列和 RGD（Arg-Gly-Asp）序列接枝到 RADA16-I 上，RGD序列與軸突生長高度相關，IKVAV 能選擇性地促進神經元方向的分化和細胞黏附，而抑制膠質細胞方向的分化和黏附；將這兩種功能化自組裝多肽制備成混合的三維水凝膠，用于修復大鼠坐骨神經5 mm 缺損，結果表明，接枝功能化片段的水凝膠在促進軸突再生和雪旺細胞遷移上效果比單純RADA16-I 水凝膠更好，證明了功能化自組裝多肽納米纖維水凝膠為周圍神經再生提供了更好的微環境。

本文用模擬神經生長因子（NGF）和 BDNF 功能的多肽片段修飾 RADA16-I，得到功能化自組裝多肽，該多肽能夠在培養基環境中自組裝成水凝膠，具有類似細胞外基質的微觀形貌。將該水凝膠用于神經類細胞的培養，結果表明其具有良好的生物相容性，兩者的協同作用能夠明顯促進軸突生長。

表 1 實驗所用多肽Table 1 List of peptides

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物及材料 SD 乳鼠由軍事醫學科學院試驗動物中心提供；實驗用自組裝多肽均由上海強耀生物科技有限公司合成；離心管、培養瓶、24 孔培養板均購自美國 Corning 公司；細胞培養小室購自美國 Millipore 公司。

1.1.2 實驗試劑 DMEM、胎牛血清 FBS 購自Gibco 公司；NB4 型膠原酶購自美國 Serna 公司；0.25% 胰蛋白酶購自美國 Sigma 公司；PBS、4%多聚甲醛、封閉山羊血清、Triton X-100 購自中國Solarbio 公司；小鼠來源 S100 單克隆抗體購自美國 Sigma 公司；山羊抗小鼠單克隆抗體 Alexa 488購自美國 Novus 公司；DAPI 染色液購自北京百奧萊博科技有限公司；羅丹明鬼筆環肽購自美國Cytoskeleton 公司。

1.1.3 細胞株及培養基 大鼠 PC12 細胞系購自北京天恩澤基因科技有限公司；RPMI1640 培養基購自美國 Invitrogen 公司；馬血清、胎牛血清均購自美國 Gibco 公司；神經生長因子購自舒泰神（北京）制藥有限公司。

1.1.4 實驗儀器 Chirascan-plus 型圓二色光譜儀為英國 Applied Photophysis 公司產品；Dimension icon 原子力顯微鏡為德國 Bruker 公司產品；掃描電子顯微鏡（SEM）為德國 Zeiss 公司產品；LSM710 型共聚焦顯微鏡為德國 Leica 產品。

1.2 方法

1.2.1 自組裝多肽水凝膠的制備 實驗所用多肽及來源如表 1 所示，均由上海強耀生物科技有限公司使用多肽固相合成法合成，經過高效液相色譜法分析，純度均大于 90%。將合成的多肽粉末以10 mg/ml 的濃度溶于超純水中，用超聲探針超聲水溶液2 min，使粉末完全溶解。隨后用一次性濾器進行過濾滅菌。將兩種功能化多肽分別與 1% 的RADA16-I 溶液按照 1∶1 的體積比混合，得到RAD/RGI 和 RAD/CTD 溶液。將兩種功能化多肽和 RADA16-I 按照 2∶1∶1 的體積比混合，得到RAD/CTD + RGI 溶液。

取出無菌培養容器放入 24 孔板中，向孔板中加入 DMEM 培養基將培養容器底部的膜潤濕，然后小心地將 4 種自組裝多肽溶液 RAD、RAD/CTD、RAD/RGI 和 RAD/CTD + RGI 分別加入到培養容器中，再加入 100 μl 培養基，放入37 ℃ 細胞培養箱中 30 min 后將孔板中培養基換成新的培養基，重復 3 ～ 4 次，孵育過夜。即可得到多肽水凝膠。

1.2.2 圓二色譜（CD）分析 將配制好的 1%RADA16-I、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD +RGI 自組裝多肽溶液用超純水稀釋 100 倍，各取200 μl 放入樣品槽中，選擇路徑長度為 1 mm，波長范圍 190 ～ 260 nm。

1.2.3 原子力顯微鏡（AFM）觀察 將配制好的1% RADA16-I、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD+ RGI 自組裝多肽溶液用超純水稀釋 100 倍，各取 10 μl 稀釋液滴加到新鮮的云母片上，然后用100 μl 超純水沖洗。將云母片自然晾干后用原子力顯微鏡觀察。

1.2.4 掃描電鏡（SEM）觀察 將制備好的自組裝多肽水凝膠分別在 2.5% 的戊二醛溶液中固定過夜，采用乙醇梯度濃度（30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%）逐級脫水，每個濃度 30 min。隨后使用 CO2臨界點干燥儀將脫水后的樣品干燥。將干燥好的樣品通過導電膠粘在樣品臺上，通過真空濺射的方法在樣品表面均勻鍍上一層金膜，采用 10 kV 電壓對樣品進行掃描電鏡觀察并記錄。

1.2.5 雪旺細胞的三維培養 將出生 3 d 的 SD乳鼠處死，浸泡于醫用酒精中消毒，隨后在超凈臺中取出坐骨神經，剝除坐骨神經外膜，加入 1 ml NB4 型膠原酶，將神經剪碎，在 37 ℃ 恒溫箱內磁力攪拌 10 min，使組織消化完全，加入 DMEM/F-12（10% FBS）終止消化，將細胞接種于培養瓶中，恒溫箱中孵育 48 h。

種細胞前用 10%（W/V）的蔗糖溶液重懸雪旺細胞，將自組裝多肽溶液與濃度為 20%（W/V）的蔗糖溶液以 2∶1 的比例混合均勻。迅速將 20 μl細胞懸液（500 000 個細胞）與 100 μl 含有蔗糖的自組裝多肽溶液混合均勻，緩慢加入到 24 孔板中已潤濕好的無菌培養容器中，并加入雪旺細胞所用的培養基使自組裝多肽成凝膠。將孔板放入 37 ℃培養箱中 15 min，隨后將孔板中的培養基換成新的，再次放入培養箱中，30 min 內置換 2 次，保證細胞處于合適的 pH 環境。培養 3 d 后，用 4%多聚甲醛固定 30 min，用 PBS 清洗 3 次，每次5 min，然后加入 0.3% Triton X-100 進行透膜處理 5 min，隨后用 10% 山羊血清室溫下封閉 1 h。PBS 清洗 3 次后加入小鼠來源 S100 單克隆抗體（1∶200）放于 4 ℃ 過夜，吸走一抗后 PBS 洗3 遍，加入山羊抗小鼠單克隆抗體 Alexa 488（1∶200）室溫下孵育 1 h。PBS 清洗 3 遍后加入DAPI 染液對細胞核室溫下染色 5 min。用激光共聚焦顯微鏡觀察細胞情況。

1.2.6 水凝膠上 PC12 細胞的軸突生長 PC12細胞系在含有 10% 馬血清和 5% 胎牛血清的RPMI1640 中培養。將 PC12 細胞以 2.5 × 104個細胞/水凝膠的密度接種在水凝膠 RAD、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD + RGI 上，然后在含 5%CO2的環境中于 37 ℃ 孵育 48 h 使細胞黏附。然后用 PC12 分化培養基（RPMI1640、1% 馬血清、50 ng/ml 神經生長因子）培養 3 d。之后，PC12細胞用羅丹明鬼筆環肽染色并通過共焦激光掃描顯微鏡成像。通過 Image Pro Plus 6.0 軟件測量不同組中軸突生長的長度。

1.3 統計學處理

所得數據運用 SPSS 22 軟件處理與分析，數據以±s表示，組間比較運用方差分析，兩兩比較運用 Student'st檢驗，以P＜ 0.05 為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 自組裝多肽水凝膠的表征

在緩沖液中多肽片段自組裝形成柔軟的不透明水凝膠，其中 β 折疊在自組裝過程中起著重要作用。4 種自組裝多肽均顯示出典型的 β 折疊的色譜，在 195 nm 處有一個正峰，在 215 nm 處有一個負峰，如圖 1 所示。功能化的自組裝多肽與純 RADA16-I 相比，表現出較小的峰，表明功能片段的加入降低了 β 折疊程度，原因是 RADA16-I是自組裝的主要片段，單獨的功能化片段不能自組裝成水凝膠。

圖 1 不同自組裝多肽的圓二色譜Figure 1 CD spectra of different self-assembling peptide

圖 2 掃描電鏡觀察自組裝多肽水凝膠的微觀形貌Figure 2 SEM microstructure of self-assembling peptide hydrogels

圖 3 原子力顯微鏡觀察自組裝多肽的纖維形貌Figure 3 AFM microstructure of self-assembling peptide hydrogels

表 2 不同自組裝多肽纖維直徑Table 2 Diameters of SAP nanofibers

圖 4 雪旺細胞在自組裝多肽水凝膠中的三維培養Figure 4 SCs cultured on self-assembling peptide hydrogels

掃描電鏡和原子力顯微鏡的結果表明，RADA16-I、RAD/RGI、RAD/CTD 和 RAD/CTD +RGI 4 種自組裝多肽的宏觀和微觀結構沒有明顯差別，均形成納米尺度的纖維，如圖 2 和圖 3 所示。由于不同自組裝多肽的氨基酸數不同，因此自組裝得到的納米纖維的直徑也不同，如表 2 所示。RADA16-I 多肽水凝膠的纖維直徑最小，而RAD/CTD 的纖維直徑最大，這與它們的氨基酸數一致。SEM 結果還表明，這種納米纖維水凝膠具有類似細胞外基質的三維網絡結構，其中孔的大小為 5 ～ 200 nm。

2.2 雪旺細胞在自組裝多肽水凝膠上的生長

雪旺細胞與自組裝多肽溶液混合，通過三維培養 3 d 后，細胞形態如圖 4 所示。雪旺細胞在水凝膠中鋪展良好，說明自組裝多肽水凝膠對神經類細胞有良好的生物相容性，能夠為神經類細胞提供適宜生長的環境。

2.3 自組裝多肽水凝膠上 PC12 細胞軸突生長情況

PC12 在不同自組裝多肽水凝膠上均有分化，圖 5 結果表明，與其他組相比，RAD/CTD + RGI可以誘導軸突更快生長；此外，RAD/CTD 和RAD/RGI 組的平均軸突長度高于 RAD 組，說明功能化序列 CTDIKGKCTGACDGKQC 和RGIDKRHWNSQ 可以促進軸突生長。并且這兩個功能片段的組合比單一組有更好的軸突生長，進一步證明了 CTDIKGKCTGACDGKQC 和RGIDKRHWNSQ 對神經生長的協同作用。

3 討論

外周神經損傷修復中損傷神經再生微環境的構建十分重要，如果能為神經細胞和組織提供適宜生長的細胞外基質環境，就能夠提高外周神經的修復速度。模擬細胞外基質環境是材料設計的關鍵[10]。本研究通過固相合成法將模擬神經因子 NGF 和BDNF 功能的多肽片段連接到 RADA16-I 自組裝多肽上，并與 RADA16-I 混合，得到具有良好物理性能和生物相容性以及促神經功能的多肽水凝膠。該納米纖維水凝膠的微觀形貌與細胞外基質（ECM）相似，在體外與雪旺細胞和 PC12 細胞相容性良好，并且兩種功能化多肽協同可以加速PC12 軸突快速生長。

在組織工程中，NGF 和 BDNF 被廣泛用于神經修復，它們分別促進感覺和運動神經的修復。然而，應用外源性神經營養因子往往具有靶向性差、給藥困難、因子半衰期短的問題。更重要的是，各種神經營養因子都有其自身的作用，在組織工程中添加多種生長因子是不現實的，這不僅會增加成本，而且會增加由于不適當的生長因子引起的癌癥發病風險。而功能化的自組裝多肽片段可以避免這些問題。首先，功能化片段在機制中具有可控的生物降解特征，隨著多肽水凝膠的降解而逐步釋放；其次，它們能發揮類似神經營養因子的功能，可以作為因子的有效替代物。因此，我們使用兩種新型的功能化自組裝多肽 CTD 和 RGI 分別模擬NGF 和 BDNF 的功能。

總之，我們通過向 RADA16-I 連接CTDIKGKCTGACDGKQC 和 RGIDKRHWNSQ（分別來自 NGF 和 BDNF）多肽片段合成功能化的自組裝多肽水凝膠。通過多種表征方法證明該自組裝多肽水凝膠具有類似細胞外基質的納米纖維結構，與神經類細胞的生物相容性良好，并且兩者的協同作用能夠促進軸突快速生長。

圖 5 自組裝多肽水凝膠 RAD（A）、RAD/CTD（B）、RAD/RGI（C）和 RAD/CTD + RGI（D）上 PC12 細胞分化情況和軸突長度統計（E）Figure 5 Neurite growth of PC12 cell on RAD (A), RAD/CTD (B), RAD/RGI (C) and RAD/CTD + RGI (D) hydrogels, the neurite length (E)