吊蘭體細胞有絲分裂的制片研究

王昕桐，董宏鑫，劉麗萍

（黑龍江大學生命科學學院，黑龍江哈爾濱150080）

植物根尖染色體制片技術，是觀察植物體細胞染色體最常用的方法，也是研究染色體組型、染色體分帶、染色體畸變和姊妹染色單體變換的基礎。絕大多數高等植物是二倍體（diploid），染色體數目恒定，其根尖細胞會進行有絲分裂，且每天都有分裂高峰定點時間段，植物根尖是觀察染色體最常用的材料。在分裂高峰期取樣并固定根尖，經過染色和壓片，在普通光學顯微鏡下觀察，可以看到大量處于有絲分裂各時期的細胞和染色體[1]。

植物細胞有絲分裂有明顯的分裂周期，但其長短不同，通常在十到幾十小時之間。通過預處理可以降低細胞質的粘度，使染色體縮短分散，阻止紡錘體的形成，讓更多的細胞處于分裂中期。細胞分裂中期是染色體形態觀察和計數的最佳時期，因此預處理是決定實驗是否成功的關鍵步驟[2]。預處理可用的試劑有很多，例如秋水仙素、對二氯苯、8-羥基喹啉等。解離的目的是分解破壞分生細胞間的果膠質，細胞壁軟化或分解，使細胞和染色體容易分散；利用壓片技術將染色體處理在一個平面，便于形態、數量觀察。解離的方法有酸解法和酶解法：酸解法是用鹽酸水解根尖，步驟簡便容易掌握，廣泛應用于染色體計數、核型分析和染色體畸變的觀察。根尖分生組織經過酸解法和壓片后，都呈現單細胞；酶解法常用于染色體顯帶技術或姊妹染色體交換等研究。本實驗使用的是酸解法制片，效果良好。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本課題采用吊蘭根尖為實驗材料，水培吊蘭根尖具有生長快、分生區明顯、取材方便、二倍體植株，染色體數量適中等特點，是很好的有絲分裂制片實驗材料。吊蘭（Chlorophytum comosum;bracketplant），百合科多年生常綠草本植物。取水培吊蘭1～3毫米具有分生區的根尖為實驗材料。

1.2 實驗器具和藥品

1.2.1 用具六孔凹面皿，載玻片，蓋玻片，溫度計，試劑瓶，滴瓶，鑷子，刀片，解剖針，吸水紙。

1.2.2 藥品無水乙醇，70%乙醇，冰乙酸，鹽酸，8-羥基喹啉，堿性品紅，石碳酸，甲醛，山梨醇，中性樹膠，二甲苯。

1.2.3 試劑配制卡諾氏固定液配比：無水乙醇∶冰醋酸=3∶1；離液配比：無水乙醇∶38%鹽酸=1∶1。染色液：配方I，石碳酸品紅（Carbol．fuchsin），先配母液 A和 B。母液A：稱 3克堿性品紅，溶于100毫升的70%酒精中，此液可長期保存；母液B：取母液A 10毫升，加入90毫升的5%石碳酸水溶液，2周內使用。取母液B 45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37%的甲醛。此染色液含有較多的甲醛，在植物原生質體培養過程中，觀察細胞核分裂比較適宜。

配方Ⅱ，改良石碳酸品紅：取配方I石碳酸品紅染色液2～10毫升，加入90～98毫升45%的醋酸和1．8克山梨醇（sorbitol）。放置2周后使用染色效果顯著增強，在室溫下不產生沉淀而且比較穩定。

1.3 實驗方法

1.3.1 預處理將水培的吊蘭放在25℃左右的環境中培養，待根長到3cm左右時，分別于8:00、12:00、16:00三個時間段剪下吊蘭根尖，放入0．002mol/L的8-羥基喹啉溶液中，并分組在常溫下分別預處理 2h、3．5h、5h。

1.3.2 材料固定將前期預處理的根尖，現用現配卡諾氏固定液，固定材料15～20min后，如果長期保存可固定24h后轉移到70%乙醇中隨時取用。

1.3.3 解離將固定好的材料水洗2～3次，每次5min。放入現配的解離液（38%濃鹽酸:無水乙醇=1∶1）解離5min。

1.3.4 染色制片 沖洗解離后的材料用蒸餾水反復沖洗2～3次后，用鑷子截取5mm根尖放在清潔的載玻片上。將樣本分為兩組并標記，一組用改良苯酚品紅染液染色5min，另一組用番紅對照染液染色10min。分別加少量染色液，直接將染液滴在載玻片解離好的樣品上，蓋上蓋玻片進行觀察。

1.3.5 鏡檢將玻片標本放在干冰或冰箱凍結，后用雙面刀片迅速把蓋玻片和載玻片分開，滴上中性樹膠或透明指甲油封片，制成永久制片。利用普通光學顯微鏡觀察，10×10倍鏡找到目標細胞后，采用10×40倍鏡觀察染色體。找到不同細胞分裂時期，數清染色體個數，拍照保存。

2 結果與分析

2.1 不同采樣時間對實驗的影響

表1 不同采樣時間結果比較

由表1可知，實驗中因取樣時間不同，觀察到的結果差別較大。結果顯示，對于吊蘭根尖染色體的制片，應盡量選擇在上午7:00～9:00取樣。上午的吊蘭根尖處于分裂高峰期，樣本中處于分裂時期的細胞最多，且可以觀察到各個分裂時期的染色體形態，相較于其他時間段更易于觀察研究。

2.2 不同預處理時間對實驗的影響

8-羥基喹啉預處理可以使較多的根尖染色體處于分裂中期，此時的染色體較為短小，均勻分散在細胞中，易于查清數目與觀察形態。實驗選取8:00時樣本預處理結果記錄為表2。

表2 不同預處理時間結果比較

實驗表明，預處理時間不宜過長或過短：過短的預處理時間會使染色體形態較長，互相交錯纏繞，不易查清染色體個數；過長的預處理時間使染色體幾乎全部處于中毒狀態，染色體聚集計數困難也不易觀察到各個分裂周期的特點與染色體形態[4]。因此，吊蘭根尖染色體的最佳預處理時間應以3．5～4h 為宜。

2.3 吊蘭各個時期染色體形態

間期：制片觀察時，間期細胞個數最多，核膜核仁清晰，有明顯邊緣，此時觀察不到染色體。前期：細胞明顯變大，可以看見一些染色體呈較長螺旋狀的細絲，通過螺旋作用染色體漸漸縮短變粗，隨之染色體形態也就更加清晰，此時，染色體由兩個染色單體組成，它們在著絲點處相連接，染色體形成的同時核膜核仁消失，這標志著前期終結；中期：染色體較粗，形態數目最為清晰，觀察效果最好。由于壓片操作，本應排列在赤道面上的染色體分散開，便于染色體計數。這一時期細胞中出現紡錘絲，但要仔細觀察才可看到；后期：排列在赤道板上的每個染色體，從著絲點處分開，數量加倍，分別移向細胞兩極。當每個染色體分開獨立時，每個染色單體就成為一個新染色體，即子染色體；末期：兩組子染色體分別到達兩極后，即末期的開始。紡錘體逐漸消失，染色體已經分開呈濃縮狀態，兩個新核逐漸顯現，細胞拉長，有縊裂趨勢。此時期觀察多個細胞會發現兩個新核之間會形成細胞板。胞質分裂：明顯觀察到核仁核膜重新出現，新細胞壁將要形成，兩個細胞即將分隔開。

2.4 吊蘭染色體個數

鏡檢分裂中期細胞，可以清晰的觀察到短粗的染色體，共2n=28條。

3 結論

通過對吊蘭根尖的制片研究，觀察到了前期、中期、后期、末期理想的染色體制片結果，確定吊蘭為二倍體草本植物，且染色體數是2n=28。7:00～9:00時為吊蘭根尖分生高峰期，此時通過3．5～4h的預處理，酸解法解離，用改良石炭酸品紅滴染5min并進行壓片操作后，可以獲得分裂期完整、分裂相清晰的細胞。

為避免細胞緊貼在一起，制片過程中壓片材料要少，材料多會致使染色體沒有伸展的余地，不利于計數檢測。溫度明顯影響植物的細胞周期，在特定的溫度下培養植物根尖，便于掌握其有絲分裂高峰期，得到更多的有絲分裂周期顯著特點的細胞。解離后用鑷子敲打蓋玻片時，用力要均勻分布在蓋玻片的每一處，力過大致使細胞過于分散個別染色體丟失，或蓋玻片滑動使細胞卷曲而被迫放棄分裂相良好的細胞。