前列泰膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提高研究

倪 琳 ，朱 宇 ，魏學(xué)冰 ，張曉萍 ，馬 肖

（1.甘肅省藥品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730000；2.甘肅省食品檢驗研究院，甘肅 蘭州 730030；3.蘭州市食品藥品檢驗研究所，甘肅 蘭州 730050；4.甘肅省第二人民醫(yī)院，甘肅 蘭州 730070）

前列泰膠囊由益母草、萹蓄、紅花、油菜蜂花粉、知母（鹽炒）、黃柏（鹽炒）6味中藥材組成，具有清熱利濕、活血散結(jié)的功效，用于慢性前列腺炎（濕熱挾瘀證）的治療，現(xiàn)執(zhí)行國家藥品注冊標(biāo)準(zhǔn)YBZ15942005，包括顯微鑒別、黃柏和知母的薄層色譜鑒別以及采用薄層色譜掃描法測定鹽酸水蘇堿含量3項。為了更好地控制藥品質(zhì)量，有必要對現(xiàn)行標(biāo)準(zhǔn)進行修訂。本研究采用薄層色譜法（TLC）對制劑中黃柏的薄層色譜方法進行修訂，增加了萹蓄、紅花的薄層色譜鑒別，將鹽酸水蘇堿的薄層掃描法修訂為高效液相色譜法（HPLC）測定益母草中鹽酸水蘇堿含量，為提高前列泰膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

島津LC-20A高效液相色譜儀系列：在線脫氣機，四元泵，Lcsolution工作站，柱溫箱，ELSD-Ⅱ蒸發(fā)光散射器；KQ3200DB型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，200 W，40 kHz）；Mettler AE240電子天平（北京賽多利斯儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

前列泰膠囊（河西制藥有限責(zé)任公司，批號：20110907、20110908、20110910），鹽酸水蘇堿對照品（批號：110712-200508），鹽酸小檗堿對照品（批號：110713-200609），萹蓄對照品（批號：110861-200808），紅花對照品（批號 121051-200503）均購自中國食品藥品檢定研究院。硅膠G薄層板（青島海洋化工廠分廠），乙腈為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 定性鑒別

2.1.1 黃柏 取本品內(nèi)容物1 g，加乙醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，加甲醇5 ml溶解，作為供試品溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 ml含0.1 mg的溶液，作為對照品溶液。按前列泰膠囊處方和工藝制備黃柏陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[1]試驗方法，取上述3種溶液各5 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以甲苯- 乙酸乙酯 - 甲醇 - 異丙醇 - 濃氨水（6∶6∶3∶3∶1，V/V/V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖1。

圖1 黃柏薄層色譜圖

2.1.2 萹蓄 取本品內(nèi)容物2 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加水20 ml溶解，水液以氯仿提取兩次，每次15 ml，氯仿液棄去，水液加濃鹽酸1 ml、氯仿25 ml，水浴回流提取1 h，分取氯仿層，水浴蒸干，殘渣加甲醇2 ml，作為供試品溶液。取萹蓄對照品，加甲醇制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作為對照品溶液。按前列泰膠囊處方和工藝制備萹蓄的陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[1]試驗方法，取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠 G薄層板上，以甲苯 - 醋酸乙酯 - 甲酸（8∶3∶1，V/V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以1%三氯化鋁乙醇溶液，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品在與對照品色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾，見圖2。

2.1.3 紅花 取本品內(nèi)容物3 g，加甲醇30 ml，超聲處理30 min，濾過，濾液水浴蒸干，殘渣加水15 ml溶解，以乙醚提取兩次，每次20 ml，棄去乙醚液，水液加水飽和的正丁醇提取兩次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 ml作為供試品溶液。取紅花對照藥材2 g，加水100 ml煎煮1 h，用脫脂棉趁熱過濾，濾液濃縮至約15 ml，加乙醇使含醇量達50%，混合均勻，濾過，濾液蒸干，殘渣加水15 ml使溶解，以水飽和的正丁醇提取兩次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣加甲醇1 ml使溶解，制成對照藥材溶液。按前列泰膠囊處方和工藝制備紅花陰性樣品，按供試品溶液制備方法制成陰性對照溶液。按TLC法[2]試驗方法，取上述3種溶液各10 μl，分別點于同一硅膠G薄層板上，以氯仿-乙醚（3∶2，V/V）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外燈（365 nm）下檢視。結(jié)果顯示，供試品在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾，見圖3。

圖2 萹蓄薄層色譜圖

圖3 紅花薄層色譜圖

2.2 益母草中鹽酸水蘇堿含量測定

2.2.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗 色譜柱選用Venusil HILIC柱（4.6 mm×250.0 mm，5 μm）；流動相：乙腈 -0.2%冰醋酸（80∶20）；ELSD檢測器：空氣壓縮機 350 KPa，霧化室溫度：50℃，增益值為 2；柱溫 35℃，流速：1.0 ml/min，進樣量：10 μl。在上述色譜條件下，理論板數(shù)以鹽酸水蘇堿峰計算，均不低于2 500。供試品中的鹽酸水蘇堿與其他雜質(zhì)峰均能很好分離（分離度＞1.5），見圖 4～6。

圖4 鹽酸水蘇堿對照品高效液相色譜圖

圖5 供試品高效液相色譜圖

圖6 陰性對照高效液相色譜圖

2.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸水蘇堿對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含鹽酸水蘇堿對照品0.5 mg的溶液，即得。

2.2.3 供試品溶液的制備 取本品內(nèi)容物約1.5 g，精密稱定，精密加 95%乙醇 50 ml，稱定重量，超聲處理（120 W，40 kHz）40 min，放冷，再稱定重量，用95%乙醇補足減失的重量，濾過，精密量取續(xù)濾液25 ml。加于中性氧化鋁-改性活性炭柱上（內(nèi)徑2.5 cm，中性氧化鋁，色譜純 100～200 目，3∶1），用 95%乙醇洗脫，收集洗脫液，水浴蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至10 ml容量瓶，定容至刻度，搖勻，即得。

2.2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密吸取對照品溶液（鹽酸水蘇堿對照品 0.506 1 mg/ml）5、10、15、20、25、30 μl，按“2.2.1”項下色譜條件進樣測定，測定峰面積積分值，以對照品質(zhì)量濃度（x，μg/ml）為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)（y），得到回歸方程：y=49 323x-76 699（r=0.999 5），鹽酸水蘇堿在 2.53～15.18 μg 有良好的線性關(guān)系。

2.2.5 專屬性試驗 按處方比例及制備工藝，配制不含益母草的陰性樣品，并按“2.2.3”項下方法制備，按“2.2.1”項下色譜條件測定，結(jié)果本品在鹽酸水蘇堿對照品相應(yīng)位置無色譜峰出現(xiàn)，即本品陰性無干擾，見圖4～6。

2.2.6 儀器精密度試驗 取前列泰膠囊（批號：20110907），按“2.2.3”項下方法提取，重復(fù)進樣6次，結(jié)果鹽酸水蘇堿峰面積的RSD為0.62%，表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復(fù)性試驗 取前列泰膠囊（批號：20110907），按“2.2.3”項下方法提取供試品6份，分別測定每份的含量，鹽酸水蘇堿RSD為0.76%。

2.2.8 加樣回收率試驗 采用加樣回收法，精密稱取已知鹽酸水蘇堿含量的供試品（批號：20110907）6份，每份約1.5 g，精密稱定，分別精密加入一定量的對照品溶液（鹽酸水蘇堿6.219 0 mg/g），用氮吹儀將溶媒吹干，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定供試品中鹽酸水蘇堿含量，計算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n=6）

2.2.9 穩(wěn)定性試驗 取“2.2.7”項下樣品，分別在 0、2、4、6、8、10 h測定峰面積，鹽酸水蘇堿峰面積穩(wěn)定，RSD為0.37%，表明供試品溶液在室溫下放置10 h內(nèi)性質(zhì)基本穩(wěn)定。

2.2.10 樣品測定 取前列泰膠囊3批，按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，測定鹽酸水蘇堿含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n=3）

3 討論

3.1 不同溶媒提取方法的比較

分別以95%乙醇、70%乙醇、甲醇超聲處理40 min提取前列泰膠囊（批號：20110907）中鹽酸水蘇堿。結(jié)果顯示，95%乙醇提取鹽酸水蘇堿6.219 0 mg/g，70%乙醇提取鹽酸水蘇堿5.978 4 mg/g，甲醇提取鹽酸水蘇堿5.764 3 mg/g，故選95%乙醇作為溶媒提取鹽酸水蘇堿。

3.2 不同提取時間的比較

分別以95%乙醇作為溶媒超聲處理30 min、40 min、1 h提取前列泰膠囊（批號：20110907）中鹽酸水蘇堿結(jié)果為：5.962 3 mg/g、6.219 0 mg/g、6.189 6 mg/g。故選擇 95%乙醇超聲處理40 min提取鹽酸水蘇堿。

3.3 流動相的選擇

流動相起初使用乙腈 - 水（80∶20）[2]，甲醇 - 水（78∶22）[3]，乙腈 -0.05 mmol/L 磷酸二氫鉀溶液 - 磷酸（10∶90∶0.02）[4]，采用乙腈-0.2%冰醋酸（80∶20）洗脫，鹽酸水蘇堿峰分離度較好、基線噪音小。經(jīng)方法學(xué)驗證，該方法線性、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、準(zhǔn)確度、耐用性均符合要求，可作為前列泰膠囊質(zhì)量控制的方法。