小鼠下頜第一磨牙胚胎發育過程中的Notch信號表達

居燕云，劉婷，苗雷英，湯旭娜

(南京大學醫學院 附屬口腔醫院/南京市口腔醫院，江蘇 南京 210008)

牙齒發育啟動來源于口腔上皮分泌的誘導信號，發育早期的上皮誘導信號旁分泌到下方的牙源性間充質，激活間充質中特定的轉錄因子(Msx、Dlx、Pax)，特異性地調控牙齒發育的啟動過程，從而引導牙齒形態發生[1]。小鼠的胚胎發育僅為20 d左右,在胚胎齡(embryonic day，ED)第11.5天牙齒發育開始啟動，首先在上皮發生形態變化，表現為局部的口腔上皮增厚形成牙板并向深層的外胚間充質內陷。胚胎發育第13.5天時，牙板上皮增生形成圓形或卵圓形的上皮芽，此上皮階段稱為蕾狀期成釉器，此時成釉器內上皮細胞未見分化，其周圍的外胚間充質細胞出現聚集，包繞在上皮芽周圍。胚胎發育至14.5 d時，成釉器呈現帽狀，成釉器內的細胞開始出現分層，形成內釉上皮層、外釉上皮層和星網狀層，而成釉器下方密集的外胚間充質細胞仍未出現分化[2]。當牙胚進入16～19 d時，成釉器形成鐘狀結構，被包繞的牙源性間充質細胞增多，并出現細胞的分化，開始形成成牙本質細胞。小鼠牙胚發育早期，ED 14.5 d時，Notch蛋白在牙胚組織中特異性表達，但由于Notch通路上眾多分子參與，且與其他發育相關信號通路多有交叉。本研究擬對牙胚發育早期，探尋與決定牙胚細胞命運相關的Notch信號通路情況。

1 材料和方法

1.1 材料

1.2 方法

1.2.1 牙胚組織的分離 C57BL/6小鼠妊娠第14.5天和第18.5天，將吸入麻醉后的孕鼠頸椎脫臼法處死,剖開子宮取出胎鼠,體視顯微鏡(Nikon SMZ1500，Japan)下，分離下頜第一磨牙牙胚組織，分離后投入凍存管，4%多聚甲醛固定24 h后-80 ℃冰箱保存，石蠟定向包埋，行冠狀截面10 μm冰凍組織切片。

1.2.2 實驗分組 一組：ED 14.5 d C57BL/6小鼠下頜第一磨牙牙胚組織。二組：ED 18.5 d C57BL/6小鼠下頜第一磨牙牙胚組織。

1.2.3 免疫組織化學染色 切片PBS(pH 7.2)洗5 min ×2次，10%馬血清37 ℃封閉30 min，PBS洗5 min ×3次，一抗孵育4 ℃過夜(濃度為1∶100)，PBS洗5 min×3次，二抗(生物素標記驢抗兔多克隆IgG，濃度為1∶100)室溫孵育30 min。PBS洗5 min×3次， 三抗(辣根過氧化物酶標記鏈霉親和素,工作液)室溫孵育15 min，PBS洗5 min×4次。DAB顯微鏡下顯色至滿意，蘇木素復染細胞核，酒精梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，光學顯微鏡觀察、照相。

2 結 果

2.1 Notch蛋白在ED 14.5 d小鼠牙胚中表達

ED 14.5 d，牙齒發育帽狀期，小鼠下頜第一磨牙牙胚成釉器內有Notch1的高表達，而成釉器周圍聚集的間充質則未見明顯表達；Notch3在小鼠下頜第一磨牙牙胚成釉器及成釉器周圍聚集的間充質細胞中均有較高的表達(圖1)。

2.2 ED 18.5 d牙胚形態

分離小鼠ED 18.5 d下頜第一磨牙牙胚，根據前期研究不同發育期小鼠下頜第一磨牙組織HE染色及免疫組織化學結果為基礎，在牙胚位置去除表面口腔上皮，取出牙胚組織，此時牙胚與周圍組織連接疏松，可以完整去除，牙冠已有牙尖形態成形(圖2)。

3 討 論

本研究發現，Notch1在小鼠下頜第一磨牙成釉器高表達，而成釉器周圍聚集的間充質則未見明顯表達；Notch3在小鼠下頜第一磨牙牙胚成釉器和成釉器周圍聚集的間充質細胞中均有高表達。Notch信號通路是一條高度保守的細胞間轉導機制系統，廣泛參與各種組織細胞的分化、增殖及凋亡過程，具有重要作用[5]。之前的研究發現Notch可能是維持小鼠頜下腺中干細胞數量的重要信號分子之一[6]，也證實了Notch信號通路在增強牙髓干細胞增殖和調節分化中的潛在參與，并且在體外和體內損傷后的牙髓細胞中均活化和動態表達Notch信號[7]。Notch可能在維持牙髓干細胞的增殖和分化之間的正確平衡方面發揮重要作用，就像它們對造血干細胞那樣[8]。發育起始期及蕾狀期牙胚周圍是一個正在發育的牙囊[9]，對細胞譜系的研究表明，牙囊中的一些細胞也具有分化成牙乳頭細胞甚至牙髓細胞的能力,例如成牙本質細胞[10]。處于某一發展階段的干細胞或前體細胞可能進一步發育成其他細胞，也可能維持到成體時期[9]。牙髓干細胞存在自我更新和維持的控制機制，并且對使用牙髓干細胞進行細胞治療具有重要的潛在影響[11]。

A、B、C. Notch1在下頜第一磨牙成釉器高表達，放大倍數分別為100、200、400；D、E、F.Notch3在下頜第一磨牙成釉器及周圍聚集的間充質細胞中高表達，放大倍數分別為100、200、400；G、H.ED 14.5 d小鼠下頜第一磨牙成釉器已進入帽狀期，其周圍有明顯的間充質細胞聚集，今后將發育為牙乳頭，放大倍數分別為100、200。*.下頜發育中心；E′.成釉器；M′.間充質

圖1ED14.5d小鼠下頜第一磨牙牙胚Notch1、Notch3免疫組化結果和下頜H&E染色結果

A.綠色虛線即為下頜第一磨牙牙胚處，星標為舌；B.為去除舌的小鼠下頜組織；C.小鼠下頜左側第一磨牙牙胚取出后見綠框內所示；D.為去除的下頜第一磨牙牙胚組織，可見牙尖外形(箭頭所示)

圖2ED18.5d小鼠下頜第一磨牙牙胚分離結果

Notch1從帽狀期的牙乳頭至牙釉質、牙本質分泌期的牙髓中盡管表達較少，但它們中的一些是條索狀的，類似于神經和血管細胞，也有一些是小圓形細胞，符合干細胞的形態特征。因此，Notch1也可能是牙髓干細胞的標志物之一。Notch3不僅在發育的成釉器周細胞中表達，并且在具有發育潛力的間充質細胞中也表達。Notch1、Notch3可能參與牙胚上皮細胞的分化，尤其是成釉上皮細胞的分化，可能在牙囊、牙乳頭和牙髓發育及發育成熟后維持干細胞中發揮作用。Notch信號在牙胚發生發育過程中有非常重要的調控作用，有必要進一步探討激活Notch信號通路引導細胞增殖分化。