BTK與PKCβ在多發(fā)性骨髓瘤中表達及調(diào)控的信號通路機制研究

2018-08-10 10:56:04黃來全劉大翔

東南大學學報(醫(yī)學版) 2018年4期

黃來全,劉大翔

(1.皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院弋磯山醫(yī)院血液內(nèi)科,安徽蕪湖 241000； 2.池州市人民醫(yī)院血液內(nèi)科,安徽池州 247000)

1 材料與方法

1.1 主要試劑與材料

1.2 細胞培養(yǎng)

將人多發(fā)性骨髓瘤細胞系8226細胞置于37 ℃、體積分數(shù)5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，使用Gibco胎牛血清和1640培養(yǎng)基。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染

將8826細胞傳代，種于6 cm培養(yǎng)皿中，過夜，待細胞長到70%時換無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)，按照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑操作說明將干擾片段或者20 μg質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入細胞，靜置6 h后換有血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 構(gòu)建穩(wěn)定過表達BTK的8826細胞

1.5 PC 32765和LY333531溶劑的制備

1.6 骨髓中CD38+MM細胞的篩選

經(jīng)患者及其家屬同意，留取2015年至2017年在皖南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院血液科診治的30例MM患者和骨科20例骨盆外傷患者的骨髓液，參見文獻[6]中的方法，分選多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓血腫瘤細胞；對照樣本為骨盆外傷患者外科術(shù)中留取的3 ml骨髓血，使用淋巴細胞分離液分離淋巴細胞備用。

1.7 qR PCR檢測BTK、PKCβ和GAPDH mRNA水平

基因名稱引物序列BTK 正向引物5'-AGTACGACGTGGCCATCAAG-3' 反向引物5'-GCTATACATCAGGACTCCGGT-3'PKCβ 正向引物5'-AGCTTGTCTTAGAGGCCTTTCT-3' 反向引物5'-CCAGGAACATCAGCTTCTGACT-3'GAPDH 正向引物5'-TGGACCAAGTACATGAACCACC-3' 反向引物5'-CTGGTGATTGGACACGGTGA-3'

1.8 Western blotting檢測BTK、PKCβ、p65和GAPDH的蛋白表達水平

參照文獻[7]的方法進行跑膠、轉(zhuǎn)膜、敷抗體、洗膜、曝光。蛋白的表達情況以BTK、PKCβ、p65條帶灰度值與GAPDH條帶灰度值的比值表示。

1.9 統(tǒng)計學處理

2 結(jié) 果

2.1 BTK與PKCβ在多發(fā)性骨髓瘤患者的腫瘤細胞中陽性率高于正常人骨髓血標本

在30例MM患者的腫瘤細胞中，BTK表達陽性有9例，陽性率為30%，而在20例骨盆外傷患者的骨髓液樣本中，BTK表達陽性僅為1例，陽性率為5%；另一方面，PKCβ在MM患者腫瘤細胞中表達陽性有14例，陽性率為46.67%，而在骨盆外傷患者骨髓液樣本中表達陽性為3例，陽性率為15%(見圖1)。兩者差異均具有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。