肝竇內皮細胞對肝細胞生物學特性影響的體外研究

符思遠，羅杏英，門秀麗，張文健，婁晉寧，許誠，李宓

(1.東莞東華醫院 腎內科，廣東 東莞 523000； 2.中山大學附屬第五醫院 血液凈化中心，廣東 珠海 519000； 3.華北理工大學基礎學院 病理生理系，河北 唐山 063009；4.中日友好醫院 臨床醫學研究所，北京 100029； 5.蘇州瑞徠生物科技有限公司，江蘇 蘇州 215000； 6.深圳市第三人民醫院 肝病醫學部，廣東 深圳 518000)

肝衰竭在全球致死性疾病中排位第七，行內科保守治療其病死率也達50%～80%[1]。肝移植是治療肝衰竭最有效方法[2]，供體短缺、錯失移植時機、免疫排斥反應等問題使大部分患者不能得到及時治療[3]。采用生物型人工肝(bioartificial liver, BAL)是近年發展起來的有效治療手段，其依靠生物反應器中的肝細胞提供分泌、代謝、生物轉化和解毒等功能[4]，更大程度接近人體肝臟。肝細胞在生物反應器內的活性及功能決定了BAL的治療作用[5]。原代人肝細胞是BAL最理想的細胞材料，但體外增殖困難、體外培養功能迅速丟失等問題限制了其臨床應用，而永生化人肝細胞(IHH)通過基因轉染技術使肝細胞達到永生化，克服了上述問題[4,6]。肝細胞與非實質細胞共同培養能模擬體內微環境，維持和促進肝細胞的功能，提高代謝物產量[7-8]。本研究通過IHH與永生化人肝竇內皮細胞(IHLSEC)共培養，觀察IHH生長情況，評估肝細胞功能的變化，為進一步提高生物人工肝的合成、解毒、生物轉化等功能提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 細胞株及主要試劑

1.2 方 法

1.2.3 IHLSEC與IHH共培養的細胞生長情況 (1) 單 獨培養組：將4×105孔-1的對數生長期IHH細胞接種于6孔板中，作為對照組；(2) 共培養組：1×105孔-1的IHLSEC和4×105孔-1的攜帶EGFP基因的IHH混合接種于6孔板中。分別于24、48、72 h在熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況。

擴增片段引物序列產物長度/bpβ-actin上游:5'-GACATCCGTAAAGACCTCTAT-GCC-3'下游:5'-ATAGAGCCACCAATCCACA-CAGAG-3'173API上游:5'-ATGCTGCCCAGAAGACAGATA-3'下游:5'-CTGAAGGCGAACTCAGCCA-3'91UGT上游:5'-TTGTCTGGCTGTTCCCACTTA-3'下游:5'-GGTCCGTCAGCATGACATCA-3'85GST上游:5'-CTGCCCGTATGTCCACCTG-3'下游:5'-AGCTCCTCGACGTAGTAGAGA-3'185GS上游:5'-TAAGGACCCTAACAAGCTGGT-3'下游:5'-CCGTTTACAGGTGTGCCTCAA-3'88ALB上游:5'-TGCAACTCTTCGTGAAAC-CTATG-3'下游:5'-ACATCAACCTCTGGTCTCACC-3'135

1.2.6 微載體大規模培養 IHH、IHLSEC：將Cytopore 2按照生產商的說明進行預處理，將細胞懸液與微載體混合。單獨培養組的接種密度為8×105ml-1的IHH，共培養組接種密度為8×105ml-1的IHH和2×105ml-1的 IHLSEC混合。微載體濃度為10 mg·ml-1。細胞貼附微載體后每隔3 d更換新鮮培養基。每隔5 d，熒光顯微鏡下觀察細胞生長情況，直至細胞生長達到微載體80%以上。

1.2.7 分析培養后IHH對肝衰竭患者血漿的解毒作用 兩組微載體沉淀后去除上清，分別取10 ml加入同等體積的肝衰患者血漿，混勻后，在24孔細胞培養板中每孔加入1 ml，分別于0、24、48、72 h吸取上清(每個時間點設定5個平行樣)，以1 200 r·min-1離

心5 min，吸取上清400 μl于-20 ℃儲存。樣本收集完畢后，檢測總膽紅素、尿素濃度。

1.3 統計學處理

使用SPSS 13.0統計軟件進行統計學分析，計量資料以均數±標準差表示，行兩組獨立樣本的t檢驗，P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結 果

2.1 IHLSEC和IHH的形態及鑒定

圖1IHLSEC細胞株鑒定(400)

Fig1IHLSECcelllineidentification(400)

2a. IHH細胞株形態；2b. API的細胞免疫熒光染色

2a. IHH cell morphology; 2b. Immunofluorescence of API

圖2IHH細胞株的鑒定(200)

Fig2IHHcelllineidentification(200)

2.2 構建攜帶EGFP基因的IHH

成功轉染EGFP基因的IHH細胞形態正常，并穩定表達綠色熒光蛋白，且沒有淬滅現象。暗視野觀察可見全部存活細胞均發出綠色熒光(圖3)。

2.3 IHLSEC與IHH共培養的細胞增殖情況

單獨培養組IHH散在分布，細胞間無明顯接觸；共培養組的IHH細胞間緊密接觸，聚集成團，這種現象隨著培養時間延長愈發明顯(圖4)。

2.4 Rea time PCR分析培養后IHH功能基因的表達

單獨培養組和共培養組的IHH均能表達肝細胞特異基因API，并能表達參與氨代謝的酶GS、參與氧化還原反應的Ⅱ相酶GST、參與膽紅素代謝的酶UGT1A1以及ALB基因的表達。另外，與單獨培養組相比，共培養組 IHH的上述 mRNA表達量增高(P<0.01)(圖5)。

3a. IHH轉染EGFP基因前(明場)；3b. IHH轉染EGFP基因前(暗場)；3c. IHH轉染EGFP基因后(明場)；3d. IHH轉染EGFP基因后(暗場)

3a. IHH before transfected GFP gene (bright field);3b. IHH before transfected GFP gene (darkfield); 3c. IHH after transfected GFP gene (bright field);3d. IHH after transfected GFP gene (darkfield)

圖3熒光顯微鏡下觀察IHH的熒光情況(200)

Fig3FluorescenceofIHHobservedunderfluorescentmicroscope(200)

4a. 單獨培養24 h; 4b. 共培養24 h;4c. 單獨培養48 h; 4d. 共培養48 h; 4e. 單獨培養72 h; 4f. 共培養72 h

圖4熒光顯微鏡下觀察IHH的增殖情況(200)

Fig4ThegrowthofIHHobseredbyafluorescencemicroscope(200)

圖5培養72h后IHHGS、GST、UGT1A1、ALBmRNA表達情況

2.5 Western blotting分析培養后IHH功能蛋白表達

兩組IHH的GS、GST、UGT1A1、ALB蛋白表達均為陽性；與單獨培養組相比，共培養組 IHH的上述蛋白表達量增高(P<0.01)(圖6)。

2.6 培養后IHH對肝衰竭患者血漿的解毒作用

兩組細胞接種于微載體后與肝衰竭患者的血漿共孵育3 d后，共培養組血漿總膽紅素下降更顯著(P<0.01)(圖7)，血漿尿素水平上升更顯著(P<0.01)(圖8)。

3 討 論

圖6培養72h后IHHGS、GST、UGT1A1、ALB蛋白表達情況

圖7與肝功能衰竭患者血漿共孵育IHH對總膽紅素的影響

Fig7Plasmatotalbilirubindetectedafterthetwogroupsculturedonmicrocarriersincubatedwithplasmaofpatientswithliverfailure

圖8與肝功能衰竭患者血漿共孵育IHH對尿素的影響

Fig8Ureadetectedafterthetwogroupsculturedonmicrocarriersincubatedwithplasmaofpatientswithliverfailure

本實驗結果顯示，IHLSEC與IHH共培養能夠上調IHH特異功能基因和蛋白的表達，增強IHH的代謝、解毒、合成功能。顯微鏡下顯示，IHLSEC與IHH無明顯細胞間接觸，推測IHLSEC可能通過提高細胞間的信號和物質傳遞增強IHH的基因表達和細胞功能。

目前已有肝細胞與肝星狀細胞[17]、庫否細胞[18]、內皮細胞[19]、間充質干細胞[20]等共培養的相關研究，雖然均不同程度地促進肝細胞功能，但上述共培養體系存在著不能更好地模擬人體肝臟的結構、細胞來源異種性、細胞表型不能持久保持等問題，臨床實際應用受到限制。

生物人工肝所需要肝細胞數量應達到肝臟質量的10%～15%，即(1～2)×1010個肝細胞，如此大規模體外細胞培養按照傳統的培養方式很難實現。大孔微載體表面積與體積比值大，不易發生細胞接觸抑制，能夠實現IHH高密度增殖；IHH在微載體孔道內生長，緊密接觸，能夠模擬體內生長微環境；培養基能通過纖維素構成的微載體，使IHH充分吸收營養物質。本實驗中采用的Cytopore 2為直徑200～280 μm的大孔微載體，肝細胞直徑約20 μm，而孔道直徑約30 μm。 IHH能夠進入微載體進行大量增殖，使得體外培養大規模高活性IHH成為現實。

與單獨培養組相比，共培養組共孵育的血漿總膽紅素下降以及尿素上升均更顯著，證實了IHLSEC與IHH共培養后增強了IHH清除血漿膽紅素和血氨的能力。

總之，IHLSEC與IHH共培養能夠促進IHH細胞間的緊密連接，上調IHH特異功能基因、蛋白的表達，增強其代謝、解毒、合成功能；體外解毒實驗進一步驗證了IHLSEC與IHH在微載體Cytopore 2上共培養能夠增強IHH清除血漿膽紅素和血氨的能力，并增強其對毒性物質的抵抗能力。IHLSEC通過哪種信號通路、什么細胞因子促進肝細胞功能以及IHLSEC與IHH以多少細胞數量比例進行共培養還有待進一步研究。