梯度交聯(lián)水凝膠用于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng)與分化

張寧，李小佩，肖倩茹，曲凱云，張靜逸，黃寧平

(東南大學(xué) 生物科學(xué)與醫(yī)學(xué)工程學(xué)院/生物電子學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210096)

本研究主要探索梯度交聯(lián)水凝膠材料對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)3D延伸、生長和分化等行為的影響，為將來基于此類梯度交聯(lián)水凝膠進(jìn)行多種細(xì)胞的3D培養(yǎng)及其在醫(yī)學(xué)上的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.2 MSCs的獲取培養(yǎng)

1.3 在水凝膠上接種MSCs接種

探索不同接種濃度的MSCs在梯度交聯(lián)水凝膠的生長情況(A:5×103孔-1；B:10×103孔-1；C:20×103孔-1；D:40×103孔-1)，使用同樣的方法對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行免疫熒光染色，觀察不同接種濃度的細(xì)胞在梯度交聯(lián)水凝膠里的遷移，使用激光共聚焦顯微鏡進(jìn)行拍照觀察。對(duì)得到的照片使用Image J軟件進(jìn)行細(xì)胞骨架覆蓋度的定量分析，具體方法為通過軟件測量熒光信號(hào)在整張圖片的覆蓋百分比。

1.4 MSCs的誘導(dǎo)及分化

2 結(jié) 果

2.1 MSCs在水凝膠上的3D生長

MSCs在梯度交聯(lián)水凝膠和普通水凝膠的生長情況如圖1。具有梯度交聯(lián)的水凝膠更適合MSCs的3D生長，細(xì)胞遷移到水凝膠內(nèi)部，形狀為紡錘形(圖1A)，隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，在第3天的時(shí)候，細(xì)胞可以生長進(jìn)入到水凝膠內(nèi)200 μm處。而在普通水凝膠上，MSCs是單層的2D平面生長(圖1B)，并且隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，細(xì)胞也沒有發(fā)生遷移貫穿長入水凝膠內(nèi)部。

A. 基于梯度交聯(lián)水凝膠的MSCs生長情況;B. 基于普通水凝膠的MSCs生長情況

A. MSCs behavior on gradient hydrogel; B. MSCs behavior on homogeneous hydrogel

圖1水凝膠對(duì)MSCs生長行為的影響

Fig1MSCsmorphologyondifferenthydrogel

2.2 在梯度交聯(lián)水凝膠上不同接種濃度MSCs的3D生長

在梯度交聯(lián)水凝膠上分別接種了不同濃度的MSCs，細(xì)胞數(shù)量依次為5×103、10×103、20×103、40×103孔-1。MSCs培養(yǎng)3 d后對(duì)細(xì)胞骨架進(jìn)行免疫熒光染色。圖2和圖3分別為在梯度交聯(lián)水凝膠內(nèi)細(xì)胞生長的側(cè)面視野圖和正面視野圖。由圖2可以看出，隨著細(xì)胞接種濃度的增大，貫穿長入水凝膠內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)量越多。當(dāng)接種濃度為40×103孔-1時(shí)，水凝膠內(nèi)部的細(xì)胞數(shù)量最多(圖2D)。對(duì)MSCs細(xì)胞生長的正面視野圖使用ImageJ進(jìn)行細(xì)胞骨架覆蓋度的定量分析，得到不同接種濃度細(xì)胞的定量生長情況(圖4)。在梯度交聯(lián)水凝膠上，接種數(shù)量為5×103、10×103、20×103、40×103孔-1的細(xì)胞骨架定量覆蓋度分別依次為(8.58±0.50)、(22.71±11.01)、(24.36±3.95)、(34.30±6.55)%。因此，接種細(xì)胞數(shù)量越多，細(xì)胞骨架的覆蓋度越大。

2.3 MSCs在梯度交聯(lián)水凝膠里的誘導(dǎo)分化

MSCs在梯度交聯(lián)水凝膠里3D培養(yǎng)的分化潛能見圖5。細(xì)胞培養(yǎng)3 d后更換誘導(dǎo)培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)，1周后進(jìn)行堿性磷酸酶染色和油紅染色，觀察干細(xì)胞的成骨和成脂分化。培養(yǎng)10 d后，細(xì)胞貫穿進(jìn)入凝膠內(nèi)部。由圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)組堿性磷酸酶(紫色)和脂滴(紅色)的表達(dá)量均比對(duì)照組要高，這說明MSCs即使貫穿進(jìn)入到水凝膠內(nèi)也可以向成骨(圖5B)和成脂分化(圖5D)。在梯度交聯(lián)水凝膠建立的3D培養(yǎng)微環(huán)境中，MSCs的干細(xì)胞分化潛能沒有受到影響。

3 討 論

A. 5×103孔-1；B. 10×103孔-1；C. 20×103孔-1；D. 40×103孔-1

圖2不同接種濃度的MSCs在梯度交聯(lián)水凝膠里的生長情況(側(cè)面視野)

Fig2MSCsbehaviorwithdifferentseedingdensityongradienthydrogel(sideview)

A. 5×103孔-1；B. 10×103孔-1；C. 20×103孔-1；D. 40×103孔-1

圖3不同接種濃度的MSCs在梯度交聯(lián)水凝膠里的生長情況(正面視野)

Fig3MSCsbehaviorwithdifferentseedingdensityongradienthydrogel(overview)

A. 5×103孔-1；B. 10×103孔-1；C. 20×103孔-1；D. 40×103孔-1

圖4MSCs在梯度交聯(lián)水凝膠上細(xì)胞骨架覆蓋度

Fig4ThequantifiedsurfacecoverageofactinofMSCsongradienthydrogel

圖5在梯度交聯(lián)水凝膠中MSCs的成骨(A.對(duì)照組和B.成骨分化誘導(dǎo)組；堿性磷酸酶染色)和成脂(C.對(duì)照組和D.成脂分化誘導(dǎo)組；油紅染色)分化

Fig5Theosteogenic(A.Control,B.Inductionmedium)andadipogenic(C.Control,D.Inductionmedium)differentiationofMSCsongradienthydrogel

Anseth課題組基于不同彈性模量的水凝膠，探索了其對(duì)干細(xì)胞向成骨和成脂分化行為的影響[12]。在本研究中，我們觀察了細(xì)胞在3D空間里的誘導(dǎo)分化情況。MSCs貫穿長入水凝膠后對(duì)其進(jìn)行成骨和成脂的誘導(dǎo)分化，分化誘導(dǎo)組的堿性磷酸酶(紫色)和脂滴(紅色)的表達(dá)量均比對(duì)照組要高，這說明即使MSCs貫穿進(jìn)入到水凝膠內(nèi)部也可以向成骨和成脂分化。在梯度交聯(lián)水凝膠建立的3D培養(yǎng)微環(huán)境中，MSCs的干細(xì)胞分化潛能沒有受到影響，有利于后期研究干細(xì)胞在3D空間里的分化。

綜上所述，本研究初步探索了基于梯度交聯(lián)水凝膠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的三維培養(yǎng),顯示具有交聯(lián)梯度的水凝膠更適合干細(xì)胞的3D培養(yǎng)；而在普通水凝膠上，大多數(shù)細(xì)胞都是2D平面生長。同時(shí)在水凝膠的3D培養(yǎng)體系中，MSCs的干細(xì)胞分化潛能可以得到很好的維持。