葡萄酒相關(guān)酵母β-葡萄糖苷酶活性及影響因素研究

王鳳梅，張邦建，岳泰新

（包頭輕工職業(yè)技術(shù)學(xué)院 食品藥品學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014035）

葡萄酒釀造是一個復(fù)雜的微生物過程，期間，酵母菌起著決定性作用。在葡萄果皮表面、葡萄園及釀酒設(shè)備表面存在著大量的酵母菌，既有釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae），也有大量的非釀酒酵母（non-Saccharomyces）。由于葡萄汁在釀酒前不經(jīng)滅菌處理，這些酵母菌也參與發(fā)酵過程。葡萄汁中存在大量的芳香類物質(zhì)如萜類（terpenes）及硫醇（thiol）等，這些芳香類物質(zhì)決定著葡萄酒的香氣[1]。然而，大量的此類芳香類物質(zhì)與糖類、氨基酸等物質(zhì)相結(jié)合，從而失去了其獨有的香氣。相關(guān)研究表明，某些非釀酒酵母中含有特定的酶類，可水解芳香類物質(zhì)與糖或氨基酸之間的糖苷鍵或碳硫鍵，從而釋放芳香類物質(zhì)，提升葡萄酒的香氣與復(fù)雜性[2-3]。其中，β-葡萄糖苷酶被發(fā)現(xiàn)存在于多種非釀酒酵母中，可水解萜類與糖分子之間的糖苷鍵，使萜類得以釋放，增加葡萄酒的香氣[4]?；诖耍劸平湍概c一種乃至數(shù)種非釀酒酵母混合接種發(fā)酵被應(yīng)用于葡萄酒釀造實踐中，在保證發(fā)酵順利進(jìn)行的同時，增加并提升了葡萄酒的香氣與復(fù)雜性。LóPEZ M C等[3]研究了114株非酵母菌，并從中篩選出膜醭畢赤酵母（Pichia membranifaciens）、葡萄酒有孢漢遜酵母（Hanseniaspora vineae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、海洋嗜殺酵母（Wickerhamomyces anomalus），4個菌株都有很高的葡糖苷酶和木糖苷酶活性。研究人員還分別用4株酵母菌處理葡萄酒，使其萜烯含量增加了1.1～1.3倍。馬得草等[5]以宜賓白酒酒窖中分離的133株野生酵母為試驗菌種，采用含七葉苷培養(yǎng)基建立了快速篩選高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶野生酵母的半定量顯色法，并篩選出2株β-葡萄糖苷酶活性較高且穩(wěn)定的酵母菌株，最終鑒定為發(fā)酵畢赤酵母（Pichiafermentans）。也有報道從釀酒酵母[6]、葡萄汁有孢漢遜酵母[7]、異常畢赤酵母（Pichia anomala）[7]、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）[8]及星形假絲酵母（Candida stellata）[9]中分離到β-葡萄糖苷酶活性菌株。

本研究以內(nèi)蒙古西部地區(qū)分離到的分屬6個屬7個種的340株葡萄酒相關(guān)酵母菌株為材料，對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株進(jìn)行初篩，進(jìn)而采用對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（p-nitrophenyl-β-D-glucoside，pNPG）檢測酶活性菌株產(chǎn)胞外、胞壁結(jié)合及胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的能力，并對高酶活性菌株的β-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)進(jìn)行了研究，旨在為具有高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株的篩選及其在釀酒產(chǎn)業(yè)中的應(yīng)用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 實驗菌株[10]

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniasporauvarum）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）、星形假絲酵母（Candida stellata）、東方伊薩酵母（Issatchenkia orientalis）及克魯維畢赤酵母（Pichia kluyveri）：分離自內(nèi)蒙古西部地區(qū)。

1.1.2 化學(xué)試劑

Triton X-100、檸檬酸鹽、對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）、對硝基苯酚（p-nitrophenol，pNP）（均為分析純）：美國Sigma-Aldrich公司；β-葡萄糖苷酶（酶活6 000 U/g）：美國Amersco公司；其他所用試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基

酵母浸出粉胨葡萄糖（yeast extract peptone dextrose，YEPD）液體培養(yǎng)基：1%酵母膏，2%蛋白胨及2%葡萄糖，pH 5.0，121 ℃，滅菌20 min。

篩選培養(yǎng)基：6.7 g/L酵母氮源、5 g/L熊果素（arbutin）及20 g/L瓊脂，pH 5.0，121℃，滅菌20 min。

1.2 儀器與設(shè)備

BCN-1360型生物潔凈工作臺：北京東聯(lián)哈爾儀器制造公司；DHP-9272型電熱恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9123A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱：上海一恒科技有限公司；pHS-3C型精密pH計：上海雷磁儀器廠；Millipore超純水制備系統(tǒng)：德國默克公司；5430臺式高速離心機(jī)：德國艾本德公司；SHA-C水浴恒溫振蕩器：常州國華電器有限公司；UV-7504單光束紫外-可見分光光度計：上海新茂儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及擴(kuò)大培養(yǎng)

上述冷凍保藏的酵母菌株分別接種于YEPD液體培養(yǎng)基中，于28℃條件下靜置培養(yǎng)48 h。隨后，按5%（V/V）接種量將活化后的菌株接種于裝液量為20 mL/250 mLYEPD液體培養(yǎng)基中，于28℃、72 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實驗。

1.3.2 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株初篩

鑒于分離到的菌株較多，采用篩選培養(yǎng)基對產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株進(jìn)行初篩，篩選方法參照RODRíGUEZME等[11]報道的方法。篩選培養(yǎng)基經(jīng)高壓滅菌后，向其中添加2%（V/V）無菌的檸檬酸鐵銨溶液（1%水溶液），混合均勻后，制備篩選培養(yǎng)平板。采用劃線接種的方法將上述340個酵母菌株接種于篩選培養(yǎng)板上，于28℃條件下培養(yǎng)7 d，每天進(jìn)行觀察。產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的菌株周圍的培養(yǎng)基會形成一個深棕色暈環(huán)。

初篩菌株按5%（V/V）接種量接種于裝液量為100 mL/250 mL的YEPD液體培養(yǎng)基中，于28℃、72 r/min搖床中振蕩培養(yǎng)72 h，用于后續(xù)實驗。

1.3.3 酵母細(xì)胞透化處理

酵母細(xì)胞形成的β-葡萄糖苷酶可能分泌于細(xì)胞外、與細(xì)胞壁結(jié)合或位于細(xì)胞內(nèi)[6，9，11]。因此，需要對產(chǎn)酶菌株不同部位的酶活性進(jìn)行分析。

取5 mL上述產(chǎn)酶酵母培養(yǎng)液，離心（5 000×g、10 min，4℃）沉淀酵母細(xì)胞，上清液置于冰冷環(huán)境中，用于后續(xù)的胞外β-葡萄糖苷酶活性分析。

細(xì)胞沉淀需進(jìn)行透化處理，具體方法參照ROSI I等[9]報道的方法，略加改動。上述細(xì)胞沉淀經(jīng)冰冷的超純水洗滌后，采用pH值為7.5的75 mmol/L咪唑緩沖液（imidazole buffer solution，IBS）1 mL重懸細(xì)胞，迅速向細(xì)胞懸液中加入透化液（50 μL 0.3 mmol/L還原型谷胱甘肽，10 μL 10%Triton X-100及50 μL甲苯∶乙醇（1∶4，V/V））混合，劇烈振蕩5min后，離心收集細(xì)胞，經(jīng)冰冷的超純水洗滌2次后，細(xì)胞重懸于3 mL pH值為5.0冰冷的檸檬酸鹽緩沖液（100 mmol/L）中，用于后續(xù)的胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性分析。

另取5 mL酵母培養(yǎng)液，離心沉淀酵母細(xì)胞，經(jīng)冰冷的超純水洗滌3次后，采用3 mLpH值為5.0冰冷的檸檬酸鹽緩沖液（100 mmol/L）重懸細(xì)胞，用于后續(xù)的胞壁結(jié)合的β-葡萄糖苷酶活性分析。

1.3.4 β-葡萄糖苷酶活性測定

采用前人報道[6，9，11]β-葡萄糖苷酶分解對硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷（pNPG）形成對硝基苯酚（pNP）的方法檢測β-葡萄糖苷酶活性。

取1 mL酵母細(xì)胞懸液（透化或未透化處理）或酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液加入1 mL pNPG溶液（5 mmol/L pNPG溶于100 mmol/L檸檬酸鹽緩沖液（pH5.0））中，于28℃條件下培養(yǎng)1 h后，向反應(yīng)液中加入6 mL 1 mol/L Na2CO3溶液終止反應(yīng)。采用分光光度計測定波長400 nm處吸光度值（OD400nm值）。制備pNP濃度（1～100 nmol/mL）與OD400nm值標(biāo)準(zhǔn)曲線，確定酵母細(xì)胞內(nèi)外及胞壁結(jié)合的β-葡萄糖苷酶活性。

β-葡萄糖苷酶活定義：1 mg酵母干細(xì)胞（或1 mL酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液）1h水解pNPG形成1nmolpNP所需的β-葡萄糖苷酶量為1個酶活單位（nkat）。

1.3.5 酵母細(xì)胞接種量[9，11]

取50 mL酵母細(xì)胞懸液，經(jīng)預(yù)先稱質(zhì)量的0.45 μm濾膜過濾，酵母細(xì)胞經(jīng)超純水洗滌2次后，置于105℃烘箱中過夜，待其徹底干燥后稱質(zhì)量，確定1 mL酵母細(xì)胞培養(yǎng)液中含有的酵母細(xì)胞干質(zhì)量。

1.3.6 培養(yǎng)條件對β-葡萄糖苷酶活性的影響

從產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的不同酵母菌種中各選1株，對其胞壁結(jié)合及胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)進(jìn)行進(jìn)一步研究。細(xì)胞透化處理、酶活性測定及酵母細(xì)胞接種量的確定采用上述相同的方法。

調(diào)整YEPD液體培養(yǎng)基中的葡萄糖添加量分別為2%、4%、6%、8%及10%，pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0及7.0，無水乙醇添加量分別為0、5%、10%及15%，溫度分別為20℃、30℃、40℃及50℃條件下培養(yǎng)產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的酵母菌株，于28℃、72r/min搖床中振蕩培養(yǎng)72h后，測定不同菌株細(xì)胞壁結(jié)合及胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性，確定葡萄糖添加量、pH值、無水乙醇添加量及溫度對β-葡萄糖苷酶活性的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶菌株初篩

采用含熊果素的瓊脂培養(yǎng)基對340株酵母菌株進(jìn)行初篩，結(jié)果見表1。

表1 產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株初篩結(jié)果Table 1 Preliminary screening results of β-glucosidase producing yeast strains

由表1可知，340株初篩酵母菌株中，分屬5個屬5個種的66株酵母表現(xiàn)出β-葡萄糖苷酶活性，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）及星形假絲酵母（Candida stellata）。其中，異常畢赤酵母、星形假絲酵母及葡萄汁有孢漢遜酵母β-葡萄糖苷酶活性菌株檢出率較高，分別為100%、33.3%及26.8%；釀酒酵母及淺黃隱球酵母中檢出率較低，分別為16.7%及3.0%；而19株東方伊薩酵母及49株克魯維畢赤酵母無一菌株具有β-葡萄糖苷酶活性。此外，β-葡萄糖苷酶活性菌株的分布似乎僅與酵母菌種有關(guān)，而與其來源關(guān)系不大，不同葡萄品種來源的葡萄汁有孢漢遜酵母中，β-葡萄糖苷酶活性菌株檢出率差異不大，而來源于不同葡萄品種的克魯維畢赤酵母均無β-葡萄糖苷酶活性菌株檢出。

2.2 產(chǎn)酶菌株不同部位酶活性分析

對上述初篩出的產(chǎn)β-葡萄糖苷酶酵母菌株進(jìn)一步確定不同部位酶的活性。采用酵母細(xì)胞培養(yǎng)上清液、未透化的酵母細(xì)胞及透化的酵母細(xì)胞分解pNPG形成pNP的能力確定不同部位酶的活性。初篩出的66株酵母菌株中僅1株葡萄汁有孢漢遜酵母檢測到（5.5±0.7）nkat的胞外β-葡萄糖苷酶活性，其余菌株在本實驗條件下均未檢測到細(xì)胞外β-葡萄糖苷酶活性。由于同一菌種不同菌株產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的能力差異較大，因此，采用盒須圖（Box-and-Whisker）顯示不同菌種的酶活性，結(jié)果如圖1所示。

圖1 產(chǎn)酶菌株不同部位β-葡糖苷酶活性Fig.1 β-glucosidase activity in different parts of enzyme producing yeast strains

由圖1可知，初篩出的分屬于5個屬5個種的66株酵母菌株胞內(nèi)酶活性均大于其胞壁結(jié)合酶活性，其中，胞壁結(jié)合酶活性中位數(shù)分別為釀酒酵母4.0 nkat，葡萄汁有孢漢遜酵母20 nkat，淺黃隱球酵母3 nkat，異常畢赤酵母27 nkat，星形假絲酵母5 nkat，胞內(nèi)酶活性中位數(shù)分別為釀酒酵母67nkat，葡萄汁有孢漢遜酵母87nkat，淺黃隱球酵母16nkat，異常畢赤酵母202 nkat，星形假絲酵母20 nkat。其中，2株異常畢赤酵母的胞壁結(jié)合酶及胞內(nèi)酶活性均為最高；其次為葡萄汁有孢漢遜酵母；而釀酒酵母、淺黃隱球酵母及星型假絲酵母的酶活性相對較低。

采用透化的酵母細(xì)胞檢測胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性被前人廣泛采用[6，9，11]，其優(yōu)點在于：可以將胞內(nèi)與胞壁結(jié)合的β-葡萄糖苷酶分開；且酶處于酵母細(xì)胞內(nèi)，仍與一些生物分子相結(jié)合或發(fā)生相互作用，能夠更為真實地反映胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶的活性；易于檢測少量酵母細(xì)胞內(nèi)的β-葡萄糖苷酶活性。本實驗中β-葡萄糖苷酶的活性僅與酵母菌種有關(guān)，而與其來源無關(guān)，如異常畢赤酵母及葡萄汁有孢漢遜酵母中，胞壁結(jié)合酶及胞內(nèi)酶的活性都相對較高。

2.3 不同因素對β-葡萄糖苷酶活性的影響

對上述66株具有β-葡萄糖苷酶活性的酵母菌，從葡萄汁有孢漢遜酵母及異常畢赤酵母中各選擇1株β-葡萄糖苷酶活性最高菌株（葡萄汁有孢漢遜酵母為菌株C12，異常畢赤酵母為菌株C56），連同其他3個種的3株β-葡萄糖苷酶活性菌株（釀酒酵母為菌株C54，淺黃隱球酵母為菌株CF68，星形假絲酵母菌株為C59）一起進(jìn)行β-葡萄糖苷酶活性檢測，以最大酶活作為100%，計算相對酶活，結(jié)果見圖2。

由圖2A可知，隨著葡萄糖添加量的增加，β-葡萄糖苷酶活性呈逐漸下降的趨勢，這一下降趨勢與菌種及酶所處的位置（胞壁結(jié)合酶及胞內(nèi)酶）無關(guān)。當(dāng)培養(yǎng)液中葡萄糖添加量達(dá)到4%時，所有檢測菌株的β-葡萄糖苷酶活性下降約50%；當(dāng)葡萄糖添加量達(dá)到10%時，所有檢測菌株中的β-葡萄糖苷酶活性均下降至其最高活性的20%～40%。結(jié)果表明，葡萄糖添加量＞4%對β-葡萄糖苷酶的活性不利。

由圖2B可知，胞壁結(jié)合酶在pH值為5.0培養(yǎng)液中酶活性最高，在pH3.0～5.0或pH5.0～7.0培養(yǎng)液中，酶活性均有所下降，但下降趨勢并不劇烈；而當(dāng)pH值為3.0或7.0時，酶活性發(fā)生急劇下降，pH 7.0時的酶活性僅為最高酶活性的10%～20%。胞內(nèi)酶的最佳pH環(huán)境與胞壁結(jié)合酶略有不同，其最佳pH值為6.0，當(dāng)培養(yǎng)液pH值為5.0時，酶活性略有下降，當(dāng)培養(yǎng)液pH值為3.0或7.0時，酶活性急劇下降，pH 3.0中的酶活性僅為最佳酶活性的30%～50%。結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶的最大酶活性pH在5.0～6.0之間，胞壁結(jié)合酶與胞內(nèi)酶可能由于所處的結(jié)合狀態(tài)不同，最佳pH環(huán)境略有不同。

由圖2C可知，在乙醇體積分?jǐn)?shù)為0～15%的范圍內(nèi)，不同菌株、不同部位的β-葡萄糖苷酶活性變化不大，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的升高，酶活性略有下降，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為15%時，酶活性仍為其最高活性的80%～100%。結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶對低體積分?jǐn)?shù)乙醇的敏感性不強(qiáng)。

圖2 不同因素對β-葡糖苷酶活性的影響Fig.2 Effects of different factors on β-glucosidase activity

由圖2D可知，不同菌株中、處于不同部位的β-葡萄糖苷酶在環(huán)境溫度為40℃時均具有最佳的酶活性，隨著環(huán)境溫度升高或降低，酶活性均急劇下降，當(dāng)環(huán)境溫度為20℃時，酶活性僅為最高酶活性的30%～50%。結(jié)果表明，β-葡萄糖苷酶對環(huán)境溫度的變化較為敏感，其最適溫度為40℃。

上述結(jié)果與前人報道的結(jié)果相似。ROSI I等[9]對篩選出的分屬12個屬14個種的14株葡萄酒相關(guān)酵母菌株進(jìn)行β-葡萄糖苷酶活性檢測，僅2株菌株檢測到胞外酶活性。DELCROIX A等[12-15]雖然也檢測到釀酒酵母胞外β-葡萄糖苷酶活性，但其酶活性遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于胞壁結(jié)合及胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶活性。這些結(jié)果表明，活性菌株分解熊果素的能力主要依賴于其胞壁結(jié)合的β-葡萄糖苷酶。

3 結(jié)論

本研究從內(nèi)蒙古西部地區(qū)4種葡萄漿果表面分離到的分屬6個屬7個種的340株酵母菌株中初篩獲得66株β-葡萄糖苷酶活性菌株，這些活性菌株分屬5個屬5個種，分別為葡萄汁有孢漢遜酵母（Hanseniaspora uvarum）、釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）、淺黃隱球酵母（Cryptococcus flavescens）、異常畢赤酵母（Pichia anomala）及星形假絲酵母（Candida stellata）。

檢測的所有酶活性菌株中，除1株葡萄汁有孢漢遜酵母檢測到較低的胞外β-葡萄糖苷酶活性外，其他菌株均無法檢測到胞外酶活性。此外，所有檢測的酶活性菌株中，胞內(nèi)酶的活性均大于其胞壁結(jié)合酶的活性。從不同菌種中分離到的酶活性菌株比例與酶活性高低來看，酶活性相對較高的菌種中分離到活性菌株的比例也相對較高。

不同菌種來源的β-葡萄糖苷酶的理化性質(zhì)相同，包括對葡萄糖、乙醇的耐受力，最適pH值及最適溫度，僅胞壁結(jié)合酶與胞內(nèi)酶的最適pH值略有差異。

結(jié)果表明，釀酒酵母與異常畢赤酵母混合接種發(fā)酵有利于利用后者的β-葡萄糖苷酶降解葡萄汁中的糖苷類物質(zhì)，從而釋放芳香類物質(zhì)，增加葡萄酒的香氣。然而，由于該酶的活性隨糖添加量的升高而急劇下降，考慮到隨著葡萄汁發(fā)酵過程的進(jìn)行，葡萄汁中的糖含量逐漸降低，pH值變化不大，酒精濃度逐漸升高，而添加4%以上葡萄糖會抑制該酶的活性，因此可在發(fā)酵中后期接種異常畢赤酵母。異常畢赤酵母胞內(nèi)酶活性高于胞壁結(jié)合酶活性，因此接種經(jīng)透化處理后的該菌種有利于利用其胞內(nèi)β-葡萄糖苷酶。此外該酶在20～40℃范圍內(nèi)時，酶活性隨溫度的升高而逐漸上升，因此適當(dāng)提高發(fā)酵溫度有利于該酶的活性，但發(fā)酵溫度過高會影響到釀酒酵母的生長。本研究結(jié)果可為采用野生酵母菌種混合發(fā)酵釀制具有地區(qū)特色的葡萄酒提供理論及技術(shù)基礎(chǔ)，相關(guān)研究有待進(jìn)一步進(jìn)行。