蕎麥釀造酒中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量變化的初步研究

曹 冉，鐘繼仁，張曉龍，朱文眾*

（1.河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018；2.承德康熙酒業(yè)有限公司，河北 承德 068253）

蕎麥為蓼科（Polygonum）蕎麥屬（Fagopyrum）一年生的草本植物，因其子實(shí)呈三棱卵圓形，又稱(chēng)三角米[1]。蕎麥的種植歷史悠久，在我國(guó)分布廣泛，種植的蕎麥主要分為甜蕎（Fagopyrum esculeutummoench）和苦蕎（Fagopyrum tataricumgaench）。蕎麥具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，含有大量碳水化合物、蛋白質(zhì)、維生素和礦物質(zhì)等，營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)種類(lèi)豐富，含量平衡[2-3]。蕎麥也有其獨(dú)特的食療作用[4]，被廣泛應(yīng)用于食品等領(lǐng)域，如蕎麥酒、蕎麥茶、蕎麥醋、蕎麥掛面和蕎麥藥品等。

蕎麥中含有大量黃酮類(lèi)物質(zhì)，蘆丁是黃酮類(lèi)化合物的主要物質(zhì)，研究表明，甜蕎中蘆丁含量一般在0.02%～0.80%，苦蕎中蘆丁含量一般在1.08%～6.60%，還有少量槲皮素、異槲皮素等6種化合物存在[5-6]。黃酮類(lèi)化合物有很高的藥用價(jià)值，能降低膽固醇、血脂，改變血管的通透性，防治高血壓冠心病等疾病，還具有強(qiáng)烈的抗氧化性，能預(yù)防炎癥和癌癥[7-9]。黃酮類(lèi)物質(zhì)易溶于乙醇等有機(jī)溶劑，因此蕎麥釀酒過(guò)程中隨著酒精的產(chǎn)生，黃酮類(lèi)物質(zhì)溶解度也會(huì)隨之提高，使蕎麥酒具有營(yíng)養(yǎng)保健功能[10]。國(guó)內(nèi)已有對(duì)于蕎麥釀造酒的研究，馮耐紅[11]采用現(xiàn)代與傳統(tǒng)相結(jié)合的工藝釀造糜米苦蕎黃酒，李園園[12]采用響應(yīng)面法優(yōu)化苦蕎發(fā)酵酒發(fā)酵參數(shù)并且對(duì)貯存期間苦蕎發(fā)酵酒相關(guān)成分的變化進(jìn)行了質(zhì)量分析。但是蕎麥釀酒大多數(shù)以苦蕎為發(fā)酵原料，對(duì)于甜蕎釀酒的研究較少。

蕎麥的分布具有地域性，苦蕎的主要產(chǎn)區(qū)以西南各省區(qū)為主，華北各省區(qū)以甜蕎為主，為了提高本地區(qū)的蕎麥利用價(jià)值，本實(shí)驗(yàn)采用甜蕎作為發(fā)酵原料。采用液態(tài)發(fā)酵法[12-14]，通過(guò)單因素試驗(yàn)以及正交優(yōu)化試驗(yàn)確定蕎麥釀造酒的最佳工藝條件，將醇溶性黃酮類(lèi)物質(zhì)更多的溶解在酒體中，提高蕎麥釀造酒的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。最終得到口感好，風(fēng)味佳，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高的甜蕎釀造酒。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 樣品來(lái)源

蕎麥粉：由承德康熙酒業(yè)有限公司提供。

1.1.2 主要試劑

無(wú)水乙醇（分析純）：天津市光復(fù)科技發(fā)展有限公司；氫氧化鈉（分析純）、硝酸鋁（分析純）：天津市永大化學(xué)試劑有限公司；α-淀粉酶（酶活3 700 U/g）：北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（純度＞98%）：北京索萊寶科技有限公司；亞硝酸鈉（分析純）：天津市北方化玻購(gòu)銷(xiāo)中心；釀酒曲（紹酒風(fēng)味）：安琪酵母股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

7200分光光度計(jì)：上海天美科學(xué)儀器有限公司；PL203電子天平：梅特勒-托利多儀器有限公司；YXQ-LS-18SI滅菌鍋：上海申安醫(yī)療器械廠；LRH-150B生化培養(yǎng)箱：廣東省醫(yī)療器械廠；LXJ-IIB離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠；25mL附溫比重瓶：上海信誼儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 蕎麥酒釀造工藝流程及操作要點(diǎn)

操作要點(diǎn)：

液化：取100 g蕎麥粉，按比例加入一定量蒸餾水，然后加入1%的α-淀粉酶，70℃水浴15 min。

糊化醪：經(jīng)液化處理后，繼續(xù)在120℃條件下糊化30 min，糊化后冷卻至常溫。

發(fā)酵：糊化醪中加入不同量的釀酒曲，在20℃恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵12 d。

固液分離：發(fā)酵好的酒樣裝入離心杯中，5 000 r/min離心10 min，收集即得蕎麥酒原液。

1.3.2 分析檢測(cè)

3,5-二硝基水楊酸（dinitrosalicylic acid，DNS）比色法[15]測(cè)定蕎麥粉中淀粉的含量；酒精度的測(cè)定采用GBT15038—2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》中密度瓶法[16]；黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量測(cè)定采用紫外分光光度計(jì)法[17]。

葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：配制0.1%的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，取0、0.4 mL、0.6 mL、0.8 mL、1.2 mL、1.6 mL、2.0 mL葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液置于7支試管中，加入0.1 g/mL的檸檬酸緩沖液至2 mL，再加入1.5 mL DNS試劑，至沸水中加熱5 min，取出冷卻至室溫加入21.5mL蒸餾水，在波長(zhǎng)540 nm條件下測(cè)定吸光度值。以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的繪制：配制0.2 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別吸取0、1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液置于6支試管中，加入體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇至5mL，加5%的NaNO2溶液0.3 mL搖勻靜置5 min，加10%的Al（NO3）3溶液0.3 mL搖勻靜置5 min，加入4%的NaOH溶液2.0mL，體積分?jǐn)?shù)為30%乙醇溶液2.4mL搖勻靜置10min。在波長(zhǎng)500 nm條件下測(cè)定吸光度值。以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。

1.3.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

（1）料水比：蕎麥粉100 g，按照1∶2.0、1∶2.5、1∶3.0、1∶3.5、1∶4.0（g∶mL）的料水比添加蒸餾水，0.8%釀酒曲，20 ℃發(fā)酵10 d，測(cè)定酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)含量。

（2）加曲量：蕎麥粉100 g，料水比1∶2.5（g∶mL），按照0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%的比例添加釀酒曲，20℃發(fā)酵10 d，測(cè)定酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)含量。

（3）發(fā)酵時(shí)間：取蕎麥粉100 g，料水比1∶2.5（g∶mL），0.6%釀酒曲，20 ℃發(fā)酵6 d、8 d、10 d、12 d、14 d，測(cè)定酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)含量。

（4）發(fā)酵溫度：取蕎麥粉100 g，料水比1∶2.5（g∶mL），0.6%釀酒曲，15℃、20℃、25℃、30℃發(fā)酵10 d，測(cè)定酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)含量。

1.3.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別對(duì)料水比（A），加曲量（B），發(fā)酵時(shí)間（C）三個(gè)發(fā)酵條件進(jìn)行正交試驗(yàn)優(yōu)化，以蕎麥酒的酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率作為雙重評(píng)價(jià)指標(biāo)，最終確定出最佳的發(fā)酵工藝。正交試驗(yàn)因素與水平見(jiàn)表1。

表1 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)因素與水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experiments for fermentation process optimization

1.3.5 發(fā)酵過(guò)程中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的變化

在正交優(yōu)化結(jié)果中選取最佳的發(fā)酵條件進(jìn)行釀酒，并且每天測(cè)定黃酮類(lèi)物質(zhì)的含量。糊化后冷卻至常溫的糊化液作為0時(shí)，以后每隔24 h測(cè)定，探討發(fā)酵過(guò)程中黃酮類(lèi)物質(zhì)的變化。

1.3.6 蕎麥釀造酒參數(shù)的計(jì)算

蕎麥釀造酒的淀粉利用率及黃酮類(lèi)物質(zhì)收率計(jì)算公式如下：

2 結(jié)果與分析

2.1 蕎麥粉中淀粉含量的測(cè)定

以葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C（x，g/L）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制還原糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.1 Standard curve of glucose

由圖1可知，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為：y=0.6095x，相關(guān)系數(shù)R2=0.9918，表明二者線(xiàn)性關(guān)系良好。按照葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程測(cè)得蕎麥粉中淀粉含量為67.50%。

2.2 蕎麥粉中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量的測(cè)定

以蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度C（x，g/L）為橫坐標(biāo)，吸光度值（y）為縱坐標(biāo)繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)Fig.2 Standard curve of rutin

由圖2可知，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程為：y=9.022x-0.004，相關(guān)系數(shù)R2=0.992 4，表明二者線(xiàn)性關(guān)系良好。按照蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)的回歸方程測(cè)得蕎麥粉中黃酮類(lèi)物質(zhì)含量為0.035%。

2.3 發(fā)酵工藝優(yōu)化單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 料水比對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響

圖3 料水比對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響Fig.3 Effect of material and water ratio on alcohol content and flavonoids yield

由圖3可知，蕎麥釀造酒的酒精度隨著料水比在1∶2.0～1∶4.0（g∶mL）范圍內(nèi)的增加由13.02%vol下降至9.54%vol。蕎麥中淀粉充分水解得到還原糖，還原糖再轉(zhuǎn)化生成酒精的總量是基本相同的，因此隨著料水比的增加，酒精度呈現(xiàn)了下降的趨勢(shì)。黃酮類(lèi)物質(zhì)的收率呈現(xiàn)了先上升后下降的趨勢(shì)，在料水比1∶2.5（g∶mL）時(shí)到達(dá)最高，為48.66%。因此，選擇料水比為1∶2.5（g∶mL）。

2.3.2 釀酒曲添加量對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響

圖4 釀酒曲添加量對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響Fig.4 Effect of the distilled's yeast addition on alcohol content and flavonoids yield

由圖4可知，蕎麥釀造酒的酒精度是先隨著釀酒曲的添加量在0.2%～0.8%范圍內(nèi)增加而增加，并在釀酒曲添加量為0.8%時(shí)，酒精度達(dá)到最大值，為14.79%vol，隨后釀酒曲添加量＞0.8%，酒精度呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。釀酒曲添加過(guò)少，導(dǎo)致發(fā)酵不完全，所以酒精度過(guò)低，添加量過(guò)多，發(fā)酵過(guò)快，釀酒曲中微生物的生長(zhǎng)也會(huì)消耗一部分還原糖，并產(chǎn)生代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致酒精度也有所下降。黃酮類(lèi)物質(zhì)收率也是呈現(xiàn)了先增加后減少的趨勢(shì)，在酒曲添加量為0.6%時(shí)達(dá)到最大值，為47.66%，隨后釀酒曲添加量＞0.6%，黃酮類(lèi)物質(zhì)收率呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。因此，選擇釀酒曲添加量為0.6%。

2.3.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響Fig.5 Effect of fermentation time on alcohol content andflavonoids yield

由圖5可知，蕎麥釀造酒的酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率都是先隨著發(fā)酵時(shí)間在6～10 d范圍內(nèi)的增加而增加，在發(fā)酵時(shí)間為10 d時(shí)，二者都達(dá)到最大值，分別為13.04%vol和47.86%，隨后當(dāng)發(fā)酵時(shí)間＞10 d，酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率都呈現(xiàn)下降趨勢(shì)。發(fā)酵時(shí)間過(guò)久，還原糖大部分被消耗，釀酒曲中的微生物開(kāi)始衰亡，轉(zhuǎn)化酒精的能力下降，產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，導(dǎo)致了酒精度下降。黃酮類(lèi)物質(zhì)易溶于乙醇等有機(jī)溶劑中，和酒精度呈現(xiàn)相同的升降趨勢(shì)。因此，選擇發(fā)酵時(shí)間10 d。

2.3.4 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響

圖6 發(fā)酵溫度對(duì)酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的影響Fig.6 Effect of fermentation temperature on alcohol content and flavonoids yield

由圖6可知，蕎麥釀造酒的酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率隨著發(fā)酵溫度在15～20℃范圍內(nèi)的增加而增加，在20℃時(shí)，酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率達(dá)到最大值，分別13.12%vol和48.30%，隨后當(dāng)發(fā)酵溫度＞20℃之后，酒精度有所下降，黃酮類(lèi)物質(zhì)收率呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)。發(fā)酵溫度太低釀酒曲中的微生物活性低，還原糖轉(zhuǎn)化的酒精過(guò)少。發(fā)酵溫度太高發(fā)酵過(guò)快，釀酒曲的微生物提前進(jìn)去衰亡期，副產(chǎn)物增加，導(dǎo)致酒精度降低。因此，選擇發(fā)酵溫度為20℃。

2.4 發(fā)酵工藝優(yōu)化正交試驗(yàn)結(jié)果

在上述單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取料水比（A）、釀酒曲添加量（B）和發(fā)酵時(shí)間（C）3個(gè)因素進(jìn)行正交優(yōu)化試驗(yàn)，基于對(duì)釀造酒風(fēng)味形成和工廠大規(guī)模生產(chǎn)應(yīng)用的考慮，發(fā)酵溫度選定20℃。正交試驗(yàn)結(jié)果與分析見(jiàn)表2，方差分析分別見(jiàn)表3和表4。

表2 發(fā)酵工藝正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果與分析Table 2 Results and analysis of orthogonal experiments for fermentation process optimization

表3 以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析Table 3 Results and variance analysis of orthogonal tests using alcohol content as evaluation index

表4 以黃酮類(lèi)物質(zhì)收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)的正交試驗(yàn)結(jié)果與方差分析Table 4 Results and variance analysis of orthogonal tests using flavonoids yield as evaluation index

由表2可知，根據(jù)R值的大小可以看出，影響蕎麥酒酒精度的因素由主到次為料水比＞釀酒曲添加量＞發(fā)酵時(shí)間，最佳發(fā)酵條件組合為A1B3C2；影響蕎麥酒黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的因素由主到次為料水比＞發(fā)酵時(shí)間＞釀酒曲添加量，最佳發(fā)酵條件組合為A3B2C3。由表3可知，以酒精度為評(píng)價(jià)指標(biāo)，料水比、釀酒曲添加量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)酒精度均未有顯著影響（P＞0.05）。由表4可知，以黃酮類(lèi)物質(zhì)收率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，料水比、釀酒曲添加量和發(fā)酵時(shí)間對(duì)黃酮類(lèi)物質(zhì)收率均未有顯著影響（P＞0.05）。綜合考慮確定最佳發(fā)酵條件組合為A3B2C3，即料水比1∶3（g∶mL），釀酒曲添加量0.6%，發(fā)酵時(shí)間12 d，發(fā)酵溫度20℃，在此發(fā)酵條件下進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)，蕎麥酒酒精度和黃酮類(lèi)物質(zhì)收率分別為10.09%vol和57.36%。

2.5 發(fā)酵過(guò)程中黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的變化

圖7 發(fā)酵過(guò)程中黃酮類(lèi)物質(zhì)收率的變化Fig.7 Changes of flavonoids yield during the fermentation process

由圖7可知，在發(fā)酵過(guò)程中黃酮類(lèi)物質(zhì)收率在2～6 d時(shí)有明顯的增加，第6天后增加緩慢，在8～14 d黃酮類(lèi)物質(zhì)收率趨于穩(wěn)定，12 d后略有下降。分析原因可能是黃酮類(lèi)物質(zhì)易溶于乙醇等有機(jī)溶劑，在2～6 d時(shí)發(fā)酵醪分層，開(kāi)始產(chǎn)生酒精，上清液中黃酮類(lèi)物質(zhì)收率也明顯的上升。6～8 d還原糖轉(zhuǎn)化酒精速度減慢，酒精度增加減緩，上清液中黃酮類(lèi)物質(zhì)收率增加速度也減慢。8～14d乙醇反饋抑制作用增強(qiáng)，黃酮類(lèi)物質(zhì)收率也趨于穩(wěn)定。

3 結(jié)論

本試驗(yàn)以甜蕎作為釀酒原料，用紹興風(fēng)味的黃酒釀酒曲，采用液態(tài)發(fā)酵法進(jìn)行發(fā)酵。通過(guò)對(duì)料水比、釀酒曲添加量、發(fā)酵時(shí)間和發(fā)酵溫度四項(xiàng)單因素試驗(yàn)研究，在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上進(jìn)行正交優(yōu)化，得到最佳發(fā)酵工藝。結(jié)果表明，最佳發(fā)酵工藝為料水比1∶3（g∶mL），釀酒曲添加量0.6%，發(fā)酵時(shí)間12 d，發(fā)酵溫度20℃。在最佳發(fā)酵工藝條件下，蕎麥釀造酒酒精度10.09%vol，黃酮類(lèi)物質(zhì)收率57.36%。酒體澄清，呈現(xiàn)棕黃色，有焦香味但略顯單薄，可在后續(xù)研究中完善。